Введение

Мутации митохондриальной ДНК могут оказывать различное воздействие на биоэнергетику клеток, в частности на величину митохондриального мембранного потенциала (∆Ψm), снижение или увеличение которого негативно сказывается на клеточной жизнеспособности и может быть причиной развития патологий [1]. Снижение ∆Ψm приводит к конденсации матрикса и попаданию цитохрома с в межмембранное пространство, запуску апоптоза [2]. Увеличение ∆Ψm приводит к гиперпродукции активных форм кислорода, которые вызывают повреждения не только в митохондриях, но и во всей клетке в целом [3].

Целью настоящего исследования являлось определение влияния мутаций митохондриальной ДНК на изменение и механизм поддержания ∆Ψm.

Материалы и методы

Объектами исследования выступали линии цитоплазматических гибридов на основе клеток ТНР-1, каждая из которых имеет от 5 до 10 мутаций мтДНК.

Изучение величины ∆Ψm, а также состояние митохондриального ФАД проводили на конфокальном микроскопе ZEISS LSM 900. Для оценки уровня ∆Ψm клетки инкубировали в 25 нМ растворе TMRM в среде Хенкса в течение 45 мин при 37 °C без отмывки. Регистрацию интенсивности флуоресценции TMRM во времени проводили с записью базового сигнала с последующим добавлением СCCP (2 мкМ). Величину ∆Ψm оценивали по изменению интенсивности флуоресценции. Общее митохондриальное содержание, скорость восстановления ФАД, а также отношение ФАДН2/ФАД оценивали на основании автофлуоресценции при использовании длины волны возбуждения 488 нм. Для перевода кофермента в полностью окисленную или восстановленную форму использовали CCCP (2 мкМ) и азид натрия (10 мМ) соответственно.

Исследование состояния НАДН проводили на широкопольном флуоресцентном микроскопе с флюоритовым иммерсионным объективом х20 с использованием возбуждающего излучения ксеноновой дуговой лампы. Регистрацию автофлуоресценции осуществляли в интервале длин волн 430-480 нм при использовании возбуждающего излучения с длиной волны 340 нм. Для оценки митохондриального содержания, скорости восстановления НАД, а также соотношения НАДН/НАД были использованы CCCP (10 мкМ) для максимального увеличения дыхания и раствор ротенона (10 мМ), блокирующего комплекс I дыхательной цепи. Числовые данные представлены в виде (медиана [Q1;Q3], число проанализированных клеток). Приведенные в % значения нормированы на медиану THP-1.

Результаты

Снижение ∆Ψm относительно THP-1 (100% [86%; 119%], N=45) в мутантных клетках линий HSM1 (76% [55%; 108%], N=48) и MAM3 (72% [56%; 91%], N=60) может быть результатом увеличенного уровня гетероплазмии мутации в гене тРНКЛей (44 и 32% соответственно). Снижение ∆Ψm объясняется тем, что мутации в гене тРНКЛей нарушают конформацию и стабильность тРНК, эффективность реакции аминоацилирования. Мутации тРНК могут приводить к нарушениям механизма трансляции и, соответственно, к изменению синтеза митохондриального белка, что ведет к снижению активности комплексов I и V дыхательной цепи [4-6]. Однако в линиях MAM1 (120% [95%; 156%], N=44) и MAM2 (117% [76%; 257%], N=54) наблюдается повышение уровня ∆Ψm при степени гетероплазмии мутации гена тРНКЛей 23 и 25% соответственно. Это может объясняться включением компенсаторных механизмов поддержания ∆Ψm, которые в зависимости от набора мутаций и уровня гетероплазмии могут отличаться. В случае линии MAM2 таким механизмом поддержания ∆Ψm выступает более активная работа комплекса II ЭТЦ, что подтверждается сниженным соотношением FADH2/FAD (0,66 [0,44; 1,99], N=48) соотношением и высокой скоростью образования FADH2 (253% [121%; 372%], N=99). В цибридной линии МАМ1 обнаружено высокое соотношение FADH2/FAD (2,65 [1,28; 3,91], N=36), сниженное содержание митохондриального FAD (70% [58%; 91%], N=59), а также низкая скорость образования FADH2 (110% [56%; 156%], N=49), что свидетельствует о сниженной работе комплекса II ЭТЦ. В этой линии механизм поддержания ∆Ψm может быть связан с большим вкладом комплекса I ЭТЦ (NADH/NAD (0,28 [0,18; 0,38], N=102)), что может объясняться высоким уровнем гетероплазмии (68%) мутации в 5 субъединице комплекса I, которая, по литературным данным, отрицательно коррелирует с развитием атеросклероза [7, 8].

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда фундаментальных исследований № 22-15-00317.



1. Zorova L. D. et al. Mitochondrial membrane potential //Analytical biochemistry. – 2018. – Т. 552. – С. 50-59.

2. Gottlieb E. et al. Mitochondrial membrane potential regulates matrix configuration and cytochrome c release during apoptosis //Cell Death & Differentiation. – 2003. – Т. 10. – №. 6. – С. 709-717.

3. Zorova L. D. et al. Functional significance of the mitochondrial membrane potential //Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. – 2018. – Т. 12. – С. 20-26.

4. Lin Y. et al. A mitochondrial myopathy-associated tRNASer (UCN) 7453G> A mutation alters tRNA metabolism and mitochondrial function //Mitochondrion. – 2021. – Т. 57. – С. 1-8.

5. Martín-Jiménez R. et al. Clinical and cellular consequences of the mutation m. 12300G> A in the mitochondrial tRNALeu (CUN) gene //Mitochondrion. – 2012. – Т. 12. – №. 2. – С. 288-293.

6. Zhou M. et al. A hypertension-associated mitochondrial DNA mutation alters the tertiary interaction and function of tRNALeu (UUR) //Journal of Biological Chemistry. – 2017. – Т. 292. – №. 34. – С. 13934-13946.

7. Sazonova M. A. et al. Association of mutations in the mitochondrial genome with the subclinical carotid atherosclerosis in women //Experimental and Molecular Pathology. – 2015. – Т. 99. – №. 1. – С. 25-32.

8. Sazonova M. A. et al. Mosaicism of mitochondrial genetic variation in atherosclerotic lesions of the human aorta //BioMed research international. – 2015. – Т. 2015.

Introduction

Mutations of mitochondrial DNA can have various effects on cell bioenergetics, in particular on the mitochondrial membrane potential (∆Ψm), decrease or increase of which negatively affects cell viability and can cause pathology development [1]. A decrease in ∆Ψm leads to matrix condensation and cytochrome c entry into the intermembrane space, triggering apoptosis [2]. An increase in ∆Ψm leads to the hyperproduction of reactive oxygen species, which cause damage not only in mitochondria but in the cell as a whole [3].

The aim of the present study was to determine the effect of mitochondrial DNA mutations on the change and mechanism of ∆Ψm maintenance.

Materials and methods

The objects of the study were cytoplasmic hybrid cell lines based on THP-1 cells, each with 5 to 10 mtDNA mutations.

The ∆Ψm value as well as the state of mitochondrial FAD were studied using a ZEISS LSM 900 confocal microscope. To assess ∆Ψm levels, cells were incubated in 25 nM TMRM solution in Hanks' medium for 45 min at 37 °C without washing. TMRM fluorescence intensity over time was recorded by recording the baseline signal followed by addition of CCCP (2 μM). The value of ∆Ψm was estimated from the change in fluorescence intensity. Total mitochondrial content, FAD reduction rate, and FADH2/FAD ratio were estimated from autofluorescence using an excitation wavelength of 488 nm. CCCP (2 μM) and sodium azide (10 mM) were used to convert the coenzyme to a fully oxidized or reduced form, respectively.

The state of NADN was investigated using a wide-field fluorescence microscope with a fluorite x20 immersion objective using excitation radiation from a xenon arc lamp. Autofluorescence was recorded in the wavelength range of 430-480 nm using excitation radiation at 340 nm. CCCP (10 μM) to maximize respiration and rotenone solution (10 mM) to block respiratory chain complex I were used to estimate mitochondrial content, NAD reduction rate, and NADH/NAD ratio. Numerical data are presented as (median [Q1;Q3], number of cells analyzed). The % values given are normalized to the median THP-1.

Results

The decrease in ∆Ψm relative to THP-1 (100% [86%; 119%], N=45) in mutant cells of HSM1 (76% [55%; 108%], N=48) and MAM3 (72% [56%; 91%], N=60) lines may be the result of increased heteroplasmy mutation in the tRNALeu gene (44 and 32% respectively). The decrease in ∆Ψm is explained by the fact that mutations in the tRNALeu gene disrupt tRNA conformation and stability and the efficiency of the aminoacylation reaction. Mutations of tRNAs can lead to disruptions in the translation mechanism and, consequently, to changes in mitochondrial protein synthesis, which leads to a decrease in the activity of respiratory chain complexes I and V [4-6]. However, MAM1 (120% [95%; 156%], N=44) and MAM2 (117% [76%; 257%], N=54) lines showed increased ∆Ψm levels with a heteroplasmy tRNALeu gene mutation degree of 23 and 25%, respectively. This can be explained by the activation of compensatory mechanisms of ∆Ψm maintenance, which may differ depending on the set of mutations and the level of heteroplasmy. In the case of the MAM2 line such a mechanism for maintaining ∆Ψm is represented by a more active ETC complex II, as evidenced by a reduced FADH2/FAD ratio (0.66 [0.44; 1.99], N=48) and a high FADH2 formation rate (253% [121%; 372%], N=99). The cybrid line MAM1 showed a high FADH2/FAD ratio (2.65 [1.28; 3.91], N=36), reduced mitochondrial FAD content (70% [58%; 91%], N=59), and a low FADH2 formation rate (110% [56%; 156%], N=49), indicating reduced ETC complex II function. In this lineage, the mechanism of ∆Ψm maintenance may be associated with a large contribution of ETC complex I (NADH/NAD (0.28 [0.18; 0.38], N=102)), which may be explained by a high heteroplasmy (68%) mutation in complex I subunit 5, which, according to literature, is negatively correlated with the development of atherosclerosis [7, 8].

This work was supported by grant № 22-15-00317 from the Russian Foundation for Basic Research.



1. Zorova L. D. et al. Mitochondrial membrane potential //Analytical biochemistry. – 2018. – Т. 552. – С. 50-59.

2. Gottlieb E. et al. Mitochondrial membrane potential regulates matrix configuration and cytochrome c release during apoptosis //Cell Death & Differentiation. – 2003. – Т. 10. – №. 6. – С. 709-717.

3. Zorova L. D. et al. Functional significance of the mitochondrial membrane potential //Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. – 2018. – Т. 12. – С. 20-26.

4. Lin Y. et al. A mitochondrial myopathy-associated tRNASer (UCN) 7453G> A mutation alters tRNA metabolism and mitochondrial function //Mitochondrion. – 2021. – Т. 57. – С. 1-8.

5. Martín-Jiménez R. et al. Clinical and cellular consequences of the mutation m. 12300G> A in the mitochondrial tRNALeu (CUN) gene //Mitochondrion. – 2012. – Т. 12. – №. 2. – С. 288-293.

6. Zhou M. et al. A hypertension-associated mitochondrial DNA mutation alters the tertiary interaction and function of tRNALeu (UUR) //Journal of Biological Chemistry. – 2017. – Т. 292. – №. 34. – С. 13934-13946.

7. Sazonova M. A. et al. Association of mutations in the mitochondrial genome with the subclinical carotid atherosclerosis in women //Experimental and Molecular Pathology. – 2015. – Т. 99. – №. 1. – С. 25-32.

8. Sazonova M. A. et al. Mosaicism of mitochondrial genetic variation in atherosclerotic lesions of the human aorta //BioMed research international. – 2015. – Т. 2015.