Для выяснения организации и механизма сопряженного переноса протонов в гем-медных терминальных оксидазах проведено предстационарное исследование с адекватным временным разрешением цитохромоксидазы aa3 типа из R.sphaeroides c мутацией по ключевому остатку в протон-проводящем D канале. Изученная мутантная оксидаза сохраняет в стационарных измерениях функциональную кислород-редуктазную активность в значительной степени. Исследованние кинетики генерации мембранного потенциала встроенным в протеолипосомы мутантным ферментом свидетельствует о замедлении стадий переноса протонов, при сохранении в целом способности к перекачиванию протонов через мембрану. В кинетике генерации мембранного потенциала мутантного фермента выявлен ряд важных отличий от дикового типа, указывающих на иную артикуляцию этапов сопряженного перекачивания протонов в каталитическом цикле, несмотря на сохранение функциональной активности. Исследование позволяет сделать выводы о существенных изменениях в электрогенном механизме перекачивания протонов в мутантном ферменте, указывает на значительную устойчивость организации элементов в механизме и дает новую информацию об организации переноса протонов в D-канале в мутантной оксидазе и в диком типе.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-14-00104.

To elucidate the organization and mechanism of coupled proton transfer in heme-copper terminal oxidases, a prestationary study with adequate temporal resolution of a type aa3 cytochrome oxidase from R.sphaeroides with a mutation of the key residue in the proton-conducting D channel was carried out. The studied mutant oxidase retains functional oxygen-reductase activity to a significant extent in stationary measurements. The study of the kinetics of membrane potential generation by a mutant enzyme embedded in proteoliposomes indicates a slowdown in the stages of proton transfer, while maintaining the ability to pump protons through the membrane as a whole. In the kinetics of the generation of the membrane potential of the mutant enzyme, a number of important differences from the wild type were revealed, indicating a different articulation of the stages of coupled proton pumping in the catalytic cycle, despite the preservation of functional activity.The study allows us to draw conclusions about significant changes in the electrogenic mechanism of proton pumping in the mutant enzyme, indicates a significant stability of the organization of elements in the mechanism and provides new information about the organization of proton transfer in the D-channel in the mutant oxidase and in the wild type.

The study was carried out at the expense of a grant from the Russian Science Foundation No. 22-14-00104.