VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Механизмы трансформации энергии. Биоэнергетика. Молекулярные моторы

Взаимодействие протонофорных разобщителей с митохондриальными ферментами

Е.А. Котова1, Л.С. Хайлова1, В.С. Краснов1, Р.С. Кирсанов1, А.М. Фирсов1, Г.А. Коршунова1, Ю.Н. Антоненко1*

1.Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова ;

* antonen(at)belozersky.msu.ru

Разобщители нарушают запасание энергии в энергопреобразующих мембранах клеток, а именно: внутренней мембране митохондрий, тилакоидных мембранах хлоропластов высших растений и плазматической мембране бактерий, в виде трансмембранной разности электрохимических потенциалов протонов, называемой протон-движущей силой. Разобщители привлекли к себе внимание как возможные средства против ожирения еще до открытия основного механизма их действия, а именно: их протонофорной активности, т.е. способности осуществлять циклический перенос протонов через бислойную липидную мембрану, приводящий к диссипации протон-движущей силы. В последние 10-15 лет наблюдается всплеск интереса к разобщителям как перспективным соединениям для создания лекарств от многих болезней, в том числе противораковых, противовирусных, нейро-, нефро- и кардиопротекторных препаратов. В настоящее время поиск и изучение механизма действия новых разобщителей остается по-прежнему актуальной и интересной задачей. Данная работа о производных 7-гидроксикумарина сложилась на основе нашей предыдущей успешной серии работ по созданию флуоресцирующих разобщителей на основе известного синтетического красителя флуоресцеина. У этого соединения имеется способная к депротонированию при физиологических рН гидроксильная группа и карбоксильная группа, к которой можно присоединять алкильные заместители для повышения липофильности, а, как известно, чтобы быть эффективным протонофорным разобщителем, соединение должно иметь депротонируемую группу с подходящим рК и обладать достаточной для взаимодействия с мембраной липофильностью. Липофильные производные флуоресцеина, а именно, его октиловый и додециловый эфиры, оказались вполне эффективными разобщителями с умеренной токсичностью [1].

По той же схеме были синтезированы разобщители на основе 7-гидроксикумарина. В отличие от флуоресцеина, это природный рН-зависимый флуорофор, который содержится в лекарственных растениях семейства зонтичных (отсюда его второе название – умбеллиферон) и ряда других семейств. Его гидроксильная группа имеет рК 7,5. Проблема присоединения липофильных заместителей была решена путем поиска производных этого соединения с карбоксильной группой. В результате были синтезированы две серии сложных эфиров: умбеллиферон-3-карбоновой и умбеллиферон-4-уксусной кислот. Соединения обеих серий обладали выраженной разобщающей активностью, но эта активность удивительным образом исчезала в минутной шкале, в отличие от классических разобщителей DNP и СССР, а также упомянутого октилового эфира флуоресцеина. Поскольку на модельных мембранах ничего подобного не происходило, логично было предположить, что активность производных умбеллиферона в митохондриях исчезает вследствие ферментативного гидролиза сложноэфирной связи. И действительно, проведенный с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) анализ показал, что за 10 минут инкубации в присутствии выделенных митохондрий печени крысы эфиры обеих серий практически полностью превращались в исходные кислоты, тогда как с октиловым эфиром флуоресцеина при этом ничего подобного не происходило. Мы предположили, что ферментом, катализирующим гидролиз сложноэфирных производных умбеллиферона, является альдегиддегидрогеназа митохондрий ALDH2, эстеразная активность которой хорошо известна. Причем эта активность чувствительна к тем же ингибиторам, что и основная активность фермента – окисление ацетальдегида. Известный ингибитор альдегиддегидрогеназы, дисульфирам, вызвал подавление спада разобщающей активности эфиров умбеллиферон-содержащих кислот. Параллельно по данным ТСХ было видно подавление гидролиза этих эфиров. Мы проверили действие еще одного ингибитора митохондриальной альдегиддегидрогеназы дайдзина и пришли к заключению, что исчезновение разобщающей активности эфиров умбеллиферон-содержащих кислот связано с эстеразной активностью ALDH2. В пользу этого заключения говорят и данные статьи [2] о взаимодействии разнообразных производных кумарина с альдегиддегидрогеназой.

Известно, что в печени ALDH2 содержится в избытке по сравнению с другими органами. Поэтому можно было ожидать, что в митохондриях, выделенных из других органов, разобщающая активность эфиров умбеллиферон-содержащих кислот не будет быстро исчезать. Эксперименты на митохондриях сердца и почек подтвердили это предположение. Следовательно, сложные эфиры умбеллиферон-содержащих кислот оказались тканеспецифичными разобщителями. Стабильность разобщающей активности этих эфиров в митохондриях сердца позволила нам сравнить их действие на скорость дыхания. Оказалось, что сложные эфиры 3-карбоновой кислоты проявляют на порядок более высокую разобщающую активность, чем эфиры 4-уксусной кислоты.

Была также исследована зависимость разобщающей активности производных 7-гидроксикумарина от активности переносчика адениновых нуклеотидов ANT1. Оказалось, что снижение мембранного потенциала митохондрий сердца крысы под действием эфиров 3-карбоновой и 4-уксусной кислот частично обращается при добавлении специфического ингибитора ANT1 карбоксиатрактилозида [3,4]. Был сделан вывод о том, что подобно жирным кислотам, производные 7-гидроксикумарина осуществляют разобщающее действие в митохондриях с участием ANT1.



Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант РНФ 21-14-00062).



1. M.M. Shchepinova et al., Biochim. Biophys. Acta 1837 (2014) 149-158.

2. C.D. Buchman, T.D. Hurley, J. Med. Chem. 60 (2017) 2439-2455.

3. V.S. Krasnov et al., Bioelectrochemistry 145 (2022) 108081.

4. V.S. Krasnov et al., Arch. Biochem. Biophys. 728 (2022) 109366.

Interaction of protonophoric uncouplers with mitochondrial enzymes

E.A. Kotova1, L.S. Khailova1, V.S. Krasnov1, R.S. Kirsanov1, A.M. Firsov1, G.A. Korshunova1, Y.N. Antonenko1*

1.Lomonosov Moscow State University;

* antonen(at)belozersky.msu.ru

Uncouplers disrupt energy storage in energy-transducing cell membranes, namely, the inner membrane of mitochondria, the thylakoid membrane of chloroplasts and the plasma membrane of bacteria, in the form of a transmembrane difference of the electrochemical potentials of protons, called the proton-motive force. Uncouplers attracted attention as possible anti-obesity drugs even before the discovery of the main mechanism of their action, namely, their protonophoric activity, i.e. the ability to carry out cyclic transfer of protons through a bilayer lipid membrane, leading to the dissipation of the proton-motive force. In the last 10–15 years, uncouplers boosted high interest as promising compounds for creating medicines against many diseases, including anticancer, antiviral, neuro-, nephro-, and cardioprotective drugs. The search for and study of the mechanism of action of new uncouplers remains an urgent and interesting task. The present study of 7-hydroxycoumarin derivatives originates from our previous successful research series on the design and synthesis of fluorescent uncouplers based on the well-known synthetic dye fluorescein. This compound has a hydroxyl group that can be deprotonated at physiological pH and a carboxyl group where alkyl substituents can be attached to increase lipophilicity. Actually, to be an effective protonophoric uncoupler, a compound needs to be lipophilic. Lipophilic derivatives of fluorescein, namely, its octyl and dodecyl esters, proved to be quite effective uncouplers with moderate toxicity [1].

Uncouplers based on 7-hydroxycoumarin were synthesized according to the same scheme. Unlike fluorescein, it is a natural pH-dependent fluorophore found in medicinal plants of the umbrella family (hence its second name, umbelliferon) and a number of other families. Its hydroxyl group has a pK of 7.5. The problem of attaching lipophilic substituents was solved by searching for derivatives of this compound with a carboxyl group. Two series were synthesized: esters of umbelliferone-3-carboxylic and umbelliferone-4-acetic acids. The compounds of both series had a pronounced uncoupling activity, but this activity surprisingly disappeared on a minute scale, in contrast to the classical uncouplers DNP and CCCP, as well as the mentioned fluorescein octyl ester. Since nothing of the kind occurred on model membranes, it was logical to assume that the activity of umbelliferone derivatives in mitochondria disappears due to the enzymatic hydrolysis of the ester bond. Indeed, the analysis performed using thin layer chromatography (TLC) showed that after 10 minutes of incubation in the presence of isolated rat liver mitochondria (RLM), the esters of both series were almost completely converted into the acids, while nothing similar happened with fluorescein octyl ester. We assumed that ALDH2, whose esterase activity is well known, is the enzyme catalyzing the hydrolysis of ester derivatives of umbelliferone. Moreover, this activity is sensitive to the same inhibitors as the main activity of the enzyme, acetaldehyde oxidation. The well-known inhibitor of aldehyde dehydrogenase disulfiram suppressed the decline in the uncoupling activity of esters of umbelliferone-containing acids. In parallel, the TLC data showed the suppression of the hydrolysis of these esters. We tested the action of another inhibitor of mitochondrial aldehyde dehydrogenase, daidzin, and concluded that the disappearance of the uncoupling activity of umbelliferone-containing acid esters is associated with the esterase activity of ALDH2. This conclusion is also supported by the data on the interaction of various coumarin derivatives with aldehyde dehydrogenase [2].

It is known that liver contains ALDH2 in excess compared to other organs. Therefore, it could be expected that in mitochondria isolated from other organs, the uncoupling activity of esters of umbelliferone-containing acids would not quickly disappear. Experiments on heart and kidney mitochondria confirmed this assumption. Therefore, esters of umbelliferone-containing acids turned out to be tissue-specific uncouplers. The stability of the uncoupling activity of these esters in heart mitochondria allowed us to compare their effect on the rate of respiration. It turned out that umbelliferone-3-carboxylic acid esters exhibit an order of magnitude higher uncoupling activity than umbelliferone-4-acetic acid esters.

We also studied dependence of the uncoupling activity of 7-hydroxycoumarin derivatives on the activity of the adenine nucleotide translocase ANT1. It turned out that the decrease in the membrane potential of rat heart mitochondria in the presence of esters of 3-carboxylic and 4-acetic acids is partially reversed by the addition of the specific ANT1 inhibitor carboxyatractyloside [3,4]. It was concluded that, like fatty acids, 7-hydroxycoumarin derivatives perform an uncoupling effect in mitochondria with the participation of ANT1.



This work was financially supported by the Russian Science Foundation (Russian Science Foundation grant 21-14-00062).



1. M.M. Shchepinova et al., Biochim. Biophys. Acta 1837 (2014) 149-158.

2. C.D. Buchman, T.D. Hurley, J. Med. Chem. 60 (2017) 2439-2455.

3. V.S. Krasnov et al., Bioelectrochemistry 145 (2022) 108081.

4. V.S. Krasnov et al., Arch. Biochem. Biophys. 728 (2022) 109366.



Докладчик: Антоненко Ю.Н.
447
2023-02-08

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists