В митохондриях транспорт электронов комплексами электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) сопряжен с переносом Н+ из матрикса в межмембранное пространство. Это приводит к запасанию энергии в виде выраженной в вольтах протон-движущей силы (Δр). Энергия Δр расходуется на синтез и транспорт АТР и частично рассеивается вследствие пассивной утечки протонов [1]. В отсутствии синтеза АТР (в состоянии 4) пассивная утечка протонов рассматривается как один из механизмов потребления кислорода митохондриями. Это, так называемое, свободное дыхание (окисление) имеет важное физиологическое значение [1]. Для характеристики генерации Δр комплексами ЭТЦ митохондрий применяются стехиометрический коэффициент Н+/О (Н+/2е–) [1, 2]. Методы определения коэффициента Н+/О (Н+/2е–) для комплексов ЭТЦ изолированных митохондрий основаны на регистрации количества перенесенных через мембрану протонов в обмен на проникающий катион (К+ в присутствии валиномицина) [2]. Такой энергозависимый транспорт К+ делает невозможным непосредственное определение значений коэффициента Н+/О (Н+/2е–) при окислительном фосфорилировании и свободном дыхании. Теоретически обосновано, что значения коэффициента Н+/2е– при окислительном фосфорилировании составляют 4, 2, 4 для комплексов I, III и IV соответственно [1]. В отличие от этого, как предполагалось нами ранее [3], при свободном дыхании митохондрий значения коэффициента Н+/О составляют 4, 4 и 2 для комплексов I, III и IV соответственно.

Для определения значений коэффициента Н+/О (Н+/2е–) комплексов III и IV при свободном дыхании митохондрий предлагается новый метод, основанный на избирательном отключении одного из них. Так при окислении митохондриями сукцината избирательное отключение комплекса III приведет к снижению коэффициента Н+/О (Н+/2е–) до значения характерного для комплекса IV. В настоящей работе в качестве агентов, осуществляющих такое отключение, применены N,N,N΄,N΄-тетраметил-n-фенилендиамин (ТМФД), способный шунтировать комплекс III ЭТЦ [4], и α,ω-гексадекандикарбоновая кислота (ГДК), переключающая этот комплекс на холостой режим работы [5].

Опыты проводили на митохондриях, выделенных из печени белых крыс общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом. Протонофорную активность исследуемых соединений определяли путем индукции набухания деэнергизованных митохондрий в изотоническом растворе ацетата калия в присутствии валиномицина.

Установлено, что ТМФД и ГДК стимулируя дыхание митохондрий: а) не оказывают существенного влияния на эффективность окислительного синтеза АТР, б) не усиливают пассивную утечку протонов и в) не влияют на трансформацию энергии комплексом IV (цитохром с оксидазой). Следовательно, при окислении сукцината митохондриями печени в условиях свободного дыхания ТМФД и ГДК избирательно отключают комплекс III ЭТЦ от трансформации энергии. Скорость пассивной утечки протонов в состоянии 4 может быть определена как произведение скорости дыхания и коэффициента Н+/О [6]. Нами теоретически обосновано, что при этих условиях коэффициент Н+/О может быть определен из отношения скоростей дыхания в отсутствии и присутствии ТМФД и ГДК. Основываясь на этой модели, рассмотрено изменение коэффициента Н+/О в зависимости от стимуляции ТМФД и ГДК дыхания митохондрий в состоянии 4. Установлено, что при окислении сукцината митохондриями в процессе стимуляции свободного дыхания ТМФД и ГДК коэффициент Н+/О уменьшается и достигает минимального значения – 2. Аналогичного значения коэффициент Н+/О достигает при максимальной стимуляции ТМФД в присутствии ГДК и ГДК в присутствии ТМФД. Следовательно, действие ТМФД и ГДК при достижении их максимальных эффектов неаддитивное. Вполне вероятно, что при совместном действии ТМФД и ГДК до максимального уровня происходит полное отключение комплекса III от генерации Δр. При этих условиях в генерации Δр будет принимать участие только комплекс IV, и, характеризующий работу этого комплекса, коэффицент Н+/О равен 2.

Таким образом, в митохондриях печени при свободном дыхании, в отличие от окислительного синтеза АТР, значения коэффициента Н+/О составляют 4 и 2 для комплексов III и IV соответственно. Известно, что в процессе синтеза и транспорта АТР перемещение протонов из межмембранного пространства в матрикс сопряжено с совершением работы [1]. В отличие от этого свободное дыхание митохондрий осуществляется путем простой диффузии протонов через внутреннюю мембрану без совершения работы. Очевидно, что скорость такой диффузии зависит от общего количества протонов освобождаемых комплексами ЭТЦ в межмембранное пространство. Индукция свободного дыхания в митохондриях печени путем отключения комплекса III ЭТЦ от трансформации энергии рассматривается как один из «путей спасения» гепатоцитов при различных патологических состояниях сопровождающихся нарушениями метаболизма углеводов и липидов и усилением окислительного стресса.

1. V. P. Skulachev, A. V. Bogachev, F. O. Kasparinsky, Principles of Bioenergetics. (Springer-Verlag, Berlin. 2013).

2. S. Papa, F. Guerrieri, M. Lorusso, et al., Biochem. J. 192, 203 (1980).

3. V. N. Samartsev, A. A. Semenova, M. V. Dubinin, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 606, 163 (2022).

4. L. F. Chien, and M. D. Brand, Biochem. J. 320, 837 (1996).

5. A. A. Semenova, V. N. Samartsev, M. V. Dubinin, Biochimie. 181, 215 (2021).

6. R. K. Porter, and M. D. Brand, Nature. 362, 628 (1993).

The transport of electrons by complexes of the electron transport chain (ETC) in mitochondria is associated with the transfer of H+ from the matrix to the intermembrane space. This leads to the storage of energy in the form of proton-motive force (Δp) expressed in volts. The Δp energy is spent on the synthesis and transport of ATP and is partially dissipated due to passive leakage of protons [1]. In the absence of ATP synthesis (in state 4), passive proton leakage is considered as one of the mechanisms of oxygen consumption by mitochondria. This so-called free respiration (oxidation) is of great physiological importance [1]. To characterize the generation of Δp by mitochondrial ETC complexes, the stoichiometric H+/O (H+/2e–) ratio is used [1, 2]. Methods for determining the H+/O ratio (H+/2e–) for ETC complexes in isolated mitochondria are based on recording the amount of protons transferred across the membrane in exchange for a penetrating cation (K+ in the presence of valinomycin) [2]. Such energy-dependent transport of K+ makes it impossible to directly determine the values of the H+/O ratio (H+/2e–) during oxidative phosphorylation and free respiration. It is theoretically substantiated that the values of the H+/2e– ratio during oxidative phosphorylation are 4, 2, and 4 for complexes I, III, and IV, respectively [1]. In contrast to this, as we assumed earlier [3], during free respiration in mitochondria, the values of the H+/O ratio are 4, 4, and 2 for complexes I, III, and IV, respectively.

To determine the values of the H+/O ratio (H+/2e–) of complexes III and IV during free respiration of mitochondria, a new method based on the selective shutdown of one of them is proposed. Thus, during succinate oxidation by mitochondria, selective deactivation of complex III will lead to a decrease in the H+/O (H+/2e–) ratio to the value characteristic of complex IV. In this work, we used N,N,N΄,N΄-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) capable of shunting ETC complex III [4] and α,ω-hexadecanedicarboxylic acid (HDA), switching this complex to idle mode [5].

The experiments were carried out on mitochondria isolated from the liver of white rats by the conventional method of differential centrifugation. Mitochondrial respiration was recorded by the polarographic method. The protonophoric activity of the studied compounds was determined by inducing swelling of deenergized mitochondria in an isotonic potassium acetate solution in the presence of valinomycin.

We have found that TMPD and HDA, stimulating mitochondrial respiration, a) do not significantly affect the efficiency of ATP oxidative synthesis, b) do not increase passive proton leakage, and c) do not affect energy transformation by complex IV (cytochrome c oxidase). Consequently, when succinate is oxidized by liver mitochondria under conditions of free respiration, TMPD and HDA selectively disable ETC complex III from energy transformation. The rate of passive leakage of protons in state 4 can be determined as the product of the respiration rate and the H+/O ratio [6]. We have theoretically substantiated that under these conditions the H+/O coefficient can be determined from the ratio of respiration rates in the absence and presence of TMPD and HDA. Based on this model, the change in the H+/O ratio depending on the stimulation of mitochondrial respiration by TMPD and HDA in state 4 decreases and reaches a minimum value – 2. The H+/O ratio reaches a similar value at the maximum stimulation by TMPD in the presence of HDA and by HDA in the presence of TMPD. Consequently, the action of TMPD and HDA, when their maximum effects are reached, is non-additive. It is quite probable that under the combined action of TMPD and HDA up to the maximum level, complex III is completely switched off from the generation of Δр. Under these conditions, only complex IV will take part in the generation of Δp, and the H+/O ratio characterizing the operation of this complex is 2.

Thus, in liver mitochondria during free respiration, in contrast to the oxidative synthesis of ATP, the values of the H+/O ratio are 4 and 2 for complexes III and IV, respectively. It is known that during the synthesis and transport of ATP, the movement of protons from the intermembrane space into the matrix is associated with the performance of work [1]. In contrast, the free respiration of mitochondria is carried out by simple diffusion of protons through the inner membrane without doing work. Obviously, the rate of such diffusion depends on the total number of protons released by the ETC complexes into the intermembrane space. Induction of free respiration in liver mitochondria by disabling ETC complex III from energy transformation is considered as one of the “ways of salvation” for hepatocytes in various pathological conditions accompanied by impaired carbohydrate and lipid metabolism and increased oxidative stress.

1. V. P. Skulachev, A. V. Bogachev, F. O. Kasparinsky, Principles of Bioenergetics. (Springer-Verlag, Berlin. 2013).

2. S. Papa, F. Guerrieri, M. Lorusso, et al., Biochem. J. 192, 203 (1980).

3. V. N. Samartsev, A. A. Semenova, M. V. Dubinin, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 606, 163 (2022).

4. L. F. Chien, and M. D. Brand, Biochem. J. 320, 837 (1996).

5. A. A. Semenova, V. N. Samartsev, M. V. Dubinin, Biochimie. 181, 215 (2021).

6. R. K. Porter, and M. D. Brand, Nature. 362, 628 (1993).