VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Биофизика клетки. Мембранные и транспортные процессы

Моликсан модулирует транспорт Na+ в коже лягушки

А.В. Мельницкая1*, З.И. Крутецкая1, В.И. Бадюлина1, В.Г. Антонов2, Н.И. Крутецкая1

1.Санкт-Петербургский государственный университет;
2.Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, Санкт-Петербург, Россия;

* a.melnitskaya(at)spbu.ru

Исследование механизмов трансэпителиального транспорта веществ является интенсивно развивающимся направлением современной биофизики, физиологии и медицины. Классическими модельными объектами для исследования механизмов транспорта ионов через биологические мембраны являются кожа и мочевой пузырь амфибий.

Транспорт Na+ в осморегулирующих эпителиях представляет собой сложную, многокомпонентную систему, в работе которой принимают участие различные Na+ - транспортирующие белки и сигнальные каскады, локализованные в различных мембранах клетки, которые являются мишенью для окислительного стресса. Многочисленные остатки цистеина, локализованные в различных сегментах этих белков, определяют их редокс-чувствительность и являются мишенью для действия внутри - и внеклеточных окисляющих и восстанавливающих агентов.

Фармакологические аналоги окисленного глутатиона (GSSG) глутоксим® (динатриевая соль GSSG с d-металлом в наноконцентрации, «ФАРМА-ВАМ», Санкт-Петербург) и моликсан® (комплекс глутоксима и нуклеозида инозина, «ФАРМА-ВАМ») используются как иммуномодуляторы и цитопротекторы в комплексной терапии бактериальных, вирусных и онкологических заболеваний. Эти препараты оказывают комплексное влияние на процессы редокс-регуляции в клетках, однако тонкие биофизические механизмы их действия далеки от полного понимания.

Ранее нами было обнаружено, что GSSG и глутоксим модулируют транспорт Na+ в коже лягушки. Обнаружено, что приложение этих агентов со стороны апикальной поверхности кожи подавляет транспорт Na+, тогда как при добавлении со стороны базолатеральной поверхности кожи, GSSG и глутоксим имитируют действие инсулина и стимулируют транспорт Na+. В связи с этим, целью настоящей работы было исследование влияния другого дисульфидсодержащего препарата моликсана на транспорт Na+ в эпителии кожи лягушки.

Для измерения электрических параметров кожи лягушки Rana temporaria использовали автоматизированную установку фиксации потенциала и регистрации вольт-амперных характеристик (ВАХ). Для измерения ВАХ на кожу подавали линейно изменяющееся напряжение (ramp) со скоростью 20 мВ/с. В интервалах между измерениями ВАХ трансэпителиальный потенциал (VT) кожи поддерживали при 0 мВ (режим короткого замыкания) или при потенциале открытой цепи VOC (VOC = VT при трансэпителиальном токе IT = 0). Из ВАХ определяли электрические параметры кожи: ток короткого замыкания ISC (ISC = IT при VT = 0), VOC и трансэпителиальную проводимость gT. Транспорт Na+ оценивали как амилорид-чувствительный ISC. В конце каждого эксперимента в раствор, омывающий апикальную поверхность кожи, добавляли блокатор амилорид-чувствительных эпителиальных Na+-каналов (ENaC) амилорид (20 мкМ). Статистический анализ проводили с применением t-критерия Стьюдента. Данные представлены в виде x ± sx. Достоверными считали различия при р ≤ 0.05.

Показано, что обработка апикальной поверхности кожи лягушки моликсаном подавляет транспорт Na+. В среднем (здесь и далее n (число опытов) = 10) после приложения 100 мкг/мл моликсана к апикальной поверхности кожи лягушки ISC уменьшается на 15.76  4.32 %, а VOC снижается на 16.42  6.02 %; изменений величины gT не наблюдали. В то же время, после приложения 100 мкг/мл моликсана со стороны базолатеральной поверхности кожи, ISC возрастает на 39.24 ± 7.17 %, VOC возрастает на 41.21 ± 10.08 %; величина gT также не изменяется.

Ингибирующее влияние моликсана может быть связано с его способностью взаимодействовать с функционально значимыми остатками цистеина Na+-транспортирующих белков, что приводит к ингибированию их активности и подавлению транспорта Na+. Полученные результаты согласуется с данными литературы, согласно которым ENaC и другие Na+-транспортирующие белки быстро и обратимо ингибируются агентами, окисляющими SH-группы остатков цистеина. В то же время, моликсан, приложенный со стороны базолатеральной поверхности кожи, имитирует действие инсулина и стимулирует транспорт Na+. Полученные результаты согласуются с полученными нами ранее данными, а также с данными литературы о способности GSSG и глутоксима оказывать рецептор-опосредованное влияние на клеточные процессы. Можно предположить, что GSSG и его фармакологические аналоги глутоксим и моликсан могут взаимодействовать с богатыми цистеином экстраклеточными доменами α-субъединиц инсулинового рецептора и вызывать трансактивацию рецептора, что приводит к активации Na+-транспортирующих белков и стимуляции транспорта Na+.

Известно, что ключевые Na+ - транспортирующие белки (ENaC, Na+-K+ - ATФазы и Na+/H+ - обменники) содержат многочисленные остатки цистеина, которые являются мишенями для действия внутри- и внеклеточных окислителей и восстановителей. Однако добавление блокатора ENaC амилорида (20 мкМ) в раствор, омывающий апикальную поверхность кожи лягушки, вызывало полное подавление транспорта Na+. Можно предположить, что влияние моликсана на транспорт Na+ обусловлено, в основном, модуляцией активности ENaC.

Таким образом, в настоящей работе показано модулирующее влияние моликсана на транспорт Na+ в эпителии кожи лягушки. Полученные результаты свидетельствуют также о том, что моликсан, GSSG и глутоксим однонаправленно модулируют транспорт Na+ в коже лягушки. Можно предположить, что эффект этих дисульфидсодержащих окислителей на транспорт Na+ опосредован сходными регуляторными механизмами.

Molixan modulates Na+ transport in frog skin epithelium

A. Melnitskaya1*, Z. Krutetskaya1, V. Badulina1, V. Antonov2, N. Krutetskaya1

1.Saint-Petersburg State University;
2.Saint-Petersburg State Pediatric Medical University, Saint-Petersburg, Russia;

* a.melnitskaya(at)spbu.ru

The study of the mechanisms of transepithelial transport of substances is an intensively developing area of modern biophysics, physiology and medicine. Classical model objects for studying ion transport mechanisms across biological membranes are the skin and bladder of amphibians.

Na+ transport in osmoregulatory epithelium is a complex, multicomponent system, which involves various Na+ transporting proteins and signaling cascades localized in different cell membranes, which are the target for oxidative stress. Numerous cysteine residues localized in different segments of these proteins determine their redox sensitivity and are a target for the action of intra- and extracellular oxidizing and reducing agents.

Pharmacological analogs of oxidized glutathione (GSSG) glutoxim® (disodium salt of GSSG with nanoconcentration of d-metal, PHARMA-VAM, St. Petersburg) and molixan® (complex of glutoxim and inosine nucleoside, PHARMA-VAM) are used as immunomodulators and cytoprotectors in the complex therapy of bacterial, viral and oncological diseases. These drugs have a complex effect on the processes of redox regulation in cells, but the subtle biophysical mechanisms of their action are far from being fully understood.

Previously, we found that GSSG and glutoxim modulate Na+ transport in frog skin. Application of these agents from the apical side of the skin was found to inhibit Na+ transport, while when added from the basolateral side of the skin, GSSG and glutoxim mimic the effect of insulin and stimulate Na+ transport. In this regard, the aim of this work was to study the effect of another disulfide-containing drug, molixan, on Na+ transport in the frog skin epithelium.

To measure the electrical parameters of the frog Rana temporaria skin, we used an automated device for voltage-clamp and recording current-voltage characteristics (I–V characteristics). To measure I–V characteristics, a linearly varying voltage (ramp) was applied to the skin at a rate of 20 mV/s. In the intervals between I–V characteristics measurements, the transepithelial potential (VT) of the skin was maintained at 0 mV (short - circuit mode) or at the open - circuit potential VOC (VOC = VT at transepithelial current IT = 0). From the I–V characteristics, the skin electrical parameters were determined: short - circuit current ISC (ISC = IT at VT = 0), VOC, and transepithelial conductance gT. Na+ transport was evaluated as amiloride-sensitive ISC. At the end of each experiment, amiloride (20 μM), amiloride-sensitive epithelial Na+ - channel blocker (ENaC), was added to the solution washing the skin apical surface. Statistical analysis was performed using Student's t-test. Data are presented as x ± sx. Differences were considered significant at p ≤ 0.05.

It has been shown that the treatment of the frog skin apical surface with molixan inhibits Na+ transport. On average (here and below, n (number of experiments) = 10), after application of 100 µg/mL molixan to the frog skin apical surface, ISC decreases by 15.76 ± 4.32 %, and VOC decreases by 16.42 ± 6.02 %; no changes in gT were observed. At the same time, after application of 100 μg/mL molixan from the skin basolateral surface, ISC increases by 39.24 ± 7.17 %, VOC increases by 41.21 ± 10.08 %; the value of gT also does not change.

The inhibitory effect of molixan may be associated with its ability to interact with functionally significant cysteine residues of Na+ - transporting proteins, which leads to inhibition of their activity and suppression of Na+ transport. The obtained results are consistent with the literature data, according to which ENaC and other Na+ - transporting proteins are rapidly and reversibly inhibited by agents that oxidize SH - groups of cysteine residues. At the same time, molixan, applied from the skin basolateral surface, mimics the action of insulin and stimulates Na+ transport. The results obtained are consistent with our previous data, as well as with the literature data on the ability of GSSG and glutoxim to have a receptor-mediated effect on cellular processes. It may be assumed that GSSG and its pharmacological analogs glutoxim and molixan may interact with cysteine-rich extracellular domains of the α-subunits of the insulin receptor and cause receptor transactivation, which leads to the activation of Na+ - transporting proteins and stimulation of Na+ transport.

It is known that the key Na+ - transporting proteins (ENaC, Na+-K+ - ATPase and Na+ /H+ - exchangers) contain numerous cysteine residues, which are targets for the effect of intra- and extracellular oxidizing and reducing agents. However, the addition of the ENaC blocker amiloride (20 μM) to the solution washing the frog skin apical surface caused a complete suppression of Na+ transport. It may be assumed that the effect of molixan on Na+ transport is mainly due to the modulation of ENaC activity.

Thus, the present work shows the modulating effect of molixan on Na+ transport in the frog skin epithelium. The results obtained also indicate that molixan, GSSG, and glutoxim unidirectionally modulate Na+ transport in frog skin. It can be assumed that the effect of these disulfide-containing oxidants on Na+ transport is mediated by similar regulatory mechanisms.



Докладчик: Мельницкая А.В.
364
2022-10-30

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists