Абстракт

Были получены различные наноконструкции с липоевой кислотой (ЛК), с размером частиц от 20 до 300 нм, характеризующиеся её медленным высвобождением из наночастиц (НЧ) и высокой дисперсионной стабильностью при длительном хранении при комнатной температуре и при Т + 4 °С. Было установлено, что нанодисперсии (НД) с ЛК уменьшают в 1.5-2 раза активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) тромбоцитах (Тц), что свидетельствует об отсутствии их цитотоксичности. Было обнаружено, что наночастицы с ЛК снижают степень агрегации Тц на 45-75%, обусловленную арахидоновой кислотой и уменьшают концентрации активных форм кислорода (АФК) и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Ключевые слова: наноконструкции, липоевая кислота, тромбоциты, арахидоновая кислота, перекисное окисление липидов, активные формы кислорода.

Цереброваскулярные заболевания являются наиболее распространенными формами патологии ЦНС с высоким показателем летальных исходов [1]. К основным патогенетическим механизмам развития инсульта относят: возникновение и прогрессирование окислительного стресса, нарушения сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостазов и др. [2]. Поэтому при комплексной терапии данной патологии необходимо применять препараты, проявляющие антиоксидантное и антиагрегантное действие. Одним из наиболее перспективных антиоксидантов является липоевая кислота. Однако, она малорастворима в воде и, попадая в организм, быстро связывается с белками, биодеградирует, быстро выводится из организма что приводит к уменьшению терапевтического действия.

Целью работы является получение различных наноконструкций с ЛК для её солюбилизации в водных растворах, пролонгированного высвобождения, а также исследование их влияния на функциональную активность тромбоцитов.

В ходе работы были получены нанодисперсии с ЛК на основе фосфатидилхолина (ФХ), олигоглицерина (ОГ) и плюроника Ф68, в фосфатном буферном растворе (ФБР, рН 7.4, 0.15 мМ) с размером частиц от 20 до 350 нм. НЧ с ЛК на основе Ф68 и ОГ были гетерогенными и состояли из двух фракций НЧ: 20-70 нм (25±5%) и 110-310 нм (75±5%). Было показано, что НЧ с ЛК были дисперсионно стабильными при длительном хранении (>20 мес) при комнатной температуре и при Т +4°С. Полученные наноконструкции были электронейтральными.

Методом крио-ПЭМ было обнаружено, что нанодисперсии с ЛК представляют неоднородную систему, состоящую из однослойных и мультислойных наноструктур в основном сферической формы частиц разного размера.

Затем изучали кинетику высвобождения ЛК из наноконструкций. Было показано, что из нанодисперсий за 24 ч высвободилось не более 50±5% ЛК. Данный процесс высвобождения ЛК из НЧ может обеспечить пролонгированное действие ЛК и длительное поддержание её терапевтической концентрации в крови.

На следующем этапе работы оценивали влияние наноконструкций с ЛК на активность ЛДГ в тромбоцитах, активированных с помощью арахидоновой кислоты (АК). В результате проведенных исследований было обнаружено, что нанодисперсии с липоевой кислотой (1-4 мМ) в 1.5-2 раза снижают активность данного фермента, что свидетельствует об отсутствии их цитотоксичности.

Далее исследовали влияние наноконструкций с ЛК на агрегацию Тц, в плазме крови, выделенной из крови здоровых доноров. Агрегацию Тц индуцировали арахидоновой кислотой (АК) поскольку в результате её действия образуются различные метаболиты в т.ч. продукты ПОЛ и АФК. Было показано, что НД ЛК (1-4 мМ) на 45-85% уменьшают агрегацию Тц, обусловленную АК. Водорастворимые формы и НЧ без ЛК практически не оказывали влияния на агрегацию Тц. По-видимому, ЛК в наноконструкциях способна лучше проникать внутрь клеток за счет взаимодействия липидов с мембраной клеток или в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Антиоксидантное действие НЧ ЛК оценивали по концентрации активных форм кислорода (АФК) и тиобарбиатурат активных продуктов (ТБК-АП) в образцах обогащенной Тц плазмы инкубированных с АК. Добавление всех типов НЧ с ЛК к образцам плазмы крови приводило к значительному уменьшению количества АФК (в 2-5 раз) и ТБК-АП (5-20 раз). Наиболее эффективным антиоксидантным действием обладали все типы НД с ЛК при использовании максимальной концентрации ЛК. Предполагаемым механизмом антиагрегационного действия наноконструкций с ЛК можно считать ингибирование ею процесса инициирования продуктов пероксидации липидов и АФК с помощью АК.

Таким образом все типы нанодисперсий с липоевой кислотой являются перспективными кандидатами для дальнейших исследований молекулярно-биологических механизмов in vivo.

Работа выполнена в рамках государственного задания № гос. Регистрации: 122051600109-5 (РНИМУ им. Н.И. Пирогова) и при поддержке Фонда развития теоретической физики и математики "Базис" (№ гранта 22-1-1-28-1).

Литература

1. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. // М.: "Медицина", 2001, 328 с.

2. Щелконогов В.А., Дарнотук Е.С., Чеканов А.В., Баранова О.А. и др. Липосомальный препарат с карнозином и липоевой кислотой: получение, антиоксидантные и антиагрегантные свойства. // Биофизика, 2021, Т. 66, № 39, С. 329-337.

Abstract

Various nanoconstructions with lipoic acid (LA), with a particle size from 20 to 300 nm were obtained, characterized by its slow release from nanoparticles (NPs) and high dispersion stability during long-term storage at room temperature and at T +4 °C. It has been found that nanodispersions (ND) with LA decrease the activity of lactate dehydrogenase (LDH) in platelets (Pt) by 1.5-2 times, which indicates the absence of their cytotoxicity. It has been revealed that nanoparticles with LA suppress platelet aggregation by 45-85%, caused by arachidonic acid (AA) and reduce the concentrations of reactive oxygen species (ROS) and products of lipid peroxidation (POL).

Keywords: nanoconstructions, lipoic acid, platelets, arachidonic acid, lipid peroxidation, reactive oxygen species.

Cerebrovascular diseases are among the most common forms of CNS pathology with a high rate of deaths [1]. The main pathogenetic mechanisms of ischemic stroke include: the onset and progression of oxidative stress, disorders of vascular-platelet and coagulation hemostasis, damage to the BBB, etc. [2]. Therefore, in the complex therapy of this pathology, it is necessary to use drugs that exhibit antioxidant and antiplatelet effects. One of the most promising antioxidants is lipoic acid. However, LA is poorly soluble in water and, when it enters the body, it quickly binds to proteins, biodegrades, and is quickly excreted, which leads to a decrease in the therapeutic effect.

The purpose of this research work is to obtain various nanoconstructions with LA for its solubilization in aqueous solutions, prolonged release, as well as to study their effect on the functional activity of platelets.

In the research work, nanodispersions with LA based on phosphatidylcholine (PC), oligoglycerol (OG), and Pluronic F68 were obtained in a phosphate buffer solution (PBS, pH 7.4, 0.15 mM) with particle sizes from 20 to 350 nm. NPs with LA based on F68 and OG were heterogeneous and consisted of two fractions of NPs: 20–70 nm (25±5%) and 110–310 nm (75±5%). It has been shown that NPs with LA were dispersion stable during long-term storage (>20 months) at room temperature and at T +4°C nanoconstructions with lipoic acid were electroneutral.

Using the cryo-TEM method, it was found that nanodispersions with LA represent an heterogeneous system consisting of single-layer and multilayer nanostructures of mainly spherical particles with different size.

Then, the kinetics release of LA from nanostructures has been studied. It has been established that about 50±5% LA was released from nanodispersions in 24 h. This process of LA release from NPs can provide a prolonged action of LA and long-term maintenance of its therapeutic concentration in the blood.

At the next stage of the research work, the effect of nanoconstructions with LA on LDH activity in platelets activated by arachidonic acid (AA) was evaluated. As a result of the studies, it was found that nanodispersions with lipoic acid (1-4 mM) decrease the activity of this enzyme by 1.5-2 times, which indicates the absence of their cytotoxicity.

Then, we studied the effect of nanoconstructions with LA on the aggregation of Pt in blood plasma isolated from the blood of healthy donors. The aggregation of Pt was induced by arachidonic acid (AA), since as a result of its action, various metabolites are formed, incl. POL and ROS products. It has been shown that ND LA (1-4 mM) reduces AA-induced Pt aggregation by 45-85%. Water-soluble forms and NPs without LA had virtually no effect on Pt aggregation. Apparently, LA in nanoconstructions is better able to penetrate into cells due to the interaction of lipids with the cell membrane or as a result of receptor-mediated endocytosis.

The antioxidant effect of LA NPs was assessed by the concentration of reactive oxygen species (ROS) and thiobarbiaturate active products (TBA-AP) in samples of plasma enriched with Pt incubated by AA. The addition of all types of NPs with LA to blood plasma samples led to the significant decrease in the amount of ROS (2-5 times) and TBA-AP (5-20 times). All types of ND with LA had the most effective antioxidant effect when using the maximum concentration of LA. Inhibition of the process of initiation of lipid peroxidation products and ROS by AA can be considered as the proposed mechanism of the antiplatelet effect of nanoconstructions with LA.

Thus, all types of nanodispersions with lipoic acid are promising candidates for further studies of molecular biological mechanisms in vivo.

This work was performed within the State Assignment (State Registration no. 122051600109-5) and with the support of the Foundation for the Development of Theoretical Physics and Mathematics "Basis" (grant № 22-1-1-28-1)

References

1. Gusev E.I., Skvortsova V.I. cerebral ischemia. // M.: "Medicine", 2001, 328 p.

2. Shchelkonogov V.A., Darnotuk E.S., Chekanov A.V., Baranova O.A. Liposomal form with carnosine and lipoic acid: preparation, antioxidant and antiplatelet properties. // Biophysics, 2021, vol. 66, no. 39, pp. 329-337.