Митохондрии (МХ) играют ключевую роль в развитии большинства внутриклеточных процессов. Генетическая регуляция функционирования МХ определяется как ядерной ДНК (яДНК), так и митохондриальной ДНК (мтДНК), которая содержит гены 12S и 16S рРНК, тРНК, а также отдельных полипептидов электронтранспортной цепи (ЭТЦ) МХ. В сравнении с яДНК для мтДНК характерен существенно более высокий уровень возникновения мутаций [1,2]. По разным оценкам, частота поражений заболеваниями, которые связаны с мутациями мтДНК составляет около одного случая на 4000-5000 человек [3]. Ввиду наличия в клетке большого количества молекул мтДНК (может достигать нескольких тысяч), симптомы ассоциированных с мутациями патологий, проявляются при уровне гетероплазмии 60-90 % [4, 5]. Однако необходимо отметить, что эти данные получены в результате исследований с содержанием ограниченного (обычно, одна-две) числа мутаций мтДНК в клетке. В то время как ввиду высокой частоты повреждений мтДНК нередки случаи существенно более высокого уровня мутационной нагрузки. И в этом случае возможны различные эффекты взаимодействия, приводящие к изменению фенотипа клеток при существенно более низком уровне гетероплазмии. Молекулярные механизмы проявления мутаций мтДНК изучены в недостаточной степени. Характер изменения синтеза АТФ, митохондриального мембранного потенциала (ΔΨm), содержания и активности белков ЭТЦ, продукции АФК в различных работах отличается как качественно, так и количественно (даже при рассмотрении одних и тех же мутаций), что, вероятно, обусловлено как значениями гетероплазмии, так и сочетанием мутаций [6-9]. Таким образом, развитие исследований, целью которых является анализ связи между сложными сочетаниями мутаций мтДНК и проявляющимися на различных уровнях фенотипическими изменениями, является весьма актуальным.

Для достижения этой цели нами используются линии созданных на базе клеток ТНР-1 цибридов и имеющих 5-8 мутаций мтДНК в генах MT-RNR1, MT-TL1, MT-TL2, MT-CYTB, MT-ND1, MT-ND2, MT-ND5 и MT-ND6 с уровнем гетероплазмии от 1% до 68%. На данном этапе выполненные исследований включают анализ набора характеризующих биоэнергетику клеток параметров (уровень и механизм формирования ΔΨm; митохондриальное содержание, соотношение восстановленной и окисленной форм, а также скорость продукции НАДН и ФАДН2; содержание и скорость потребления АТФ; дыхание клеток; образование АФК; уровень митофагии).

Полученные результаты позволяют сегодня говорить о значительном влиянии исследуемых мутаций на клеточный метаболизм даже несмотря на существенно более низкие в сравнении с указанными для случая присутствия единичных мутаций уровнями гетероплазмии. В частности, мутации генов тРНКЛей оказываются значимыми уже при 20%-ном содержании при одновременном присутствии в клетке мутаций цитохрома b (m.14846G>A) или субъединиц комплекса I ЭТЦ (m.5178C>A, m.14459G>A). Для всех линий характерно значительное снижение уровня АТФ при отсутствии положительной корреляции данного параметра с временем полного исчерпания макроэрга при блокировании путей его биосинтеза. Это свидетельствует о различных причинах дефицита энергии – от нарушений образования АТФ до гиперактивации активно потребляющих его процессов. Представленные в цибридах сочетания мутаций ассоциированы со значительным уровнем разобщения окислительного фосфорилирования, которое может быть способ снижения негативных последствий гиперпродукции АФК как в матрикс МХ, так и межмембранное пространство при дисфункции участников ЭТЦ. Связанные с мутациями генов отдельных белков, а также генов тРНК нарушения работы комплекса I далеко не во всех линиях компенсируются увеличением уровня экспрессии или активности кодируемой яДНК сукцинатдегидрогеназы, что говорит об ограниченности применения субстратов комплекса II как инструмента защиты клеток при наличии мутаций мтДНК. Ряд цибридов характеризуется инверсным режимом функционирования комплекса V ЭТЦ, который позволяет поддерживать уровень ΔΨm за счет расходования при этом АТФ. Несмотря на выявленные нарушения, некоторые линии цибридов характеризуются дефектной митофагией, приводящей к накоплению нефункциональных органелл. В ряде случае сочетания мутаций могут приводить к улучшению характеризующих состояние клеток параметров, что наблюдается, в частности, при наличии мутаций m.13513G>A и m.1555A>G в генах MT-ND1 и MT-RNR1 соответственно.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда N 22-15-00317.



1. Kim H.R. et al. Mitochondrial DNA aberrations and pathophysiological implications in hematopoietic diseases, chronic inflammatory diseases, and cancers // Ann. Lab. Med. 2015. 35:1–14.

2. Kazak L. et al. Minimizing the damage: Repair pathways keep mitochondrial DNA intact // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012. 13:659–671.

3. Gorman G.S. et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease // Ann. Neurol. 2015. 77:753–759.

4. Haig D. Intracellular evolution of mitochondrial DNA (mtDNA) and the tragedy of the cytoplasmic commons // Bioessays. 2016. 38:549–555

5. Yoneda M. et al. Heteroplasmic mitochondrial tRNA(Lys) mutation and its complementation in MERRF patient-derived mitochondrial transformants // Muscle Nerve Suppl. 1995. 3:95–101.

6. Lee S.R. et al. Mitochondrial DNA, mitochondrial dysfunction, and cardiac manifestations // Front. Biosci. 2017. 22:1177–1194.

7. von Kleist-Retzow J.C. et al. Impaired mitochondrial Ca2+ homeostasis in respiratory chain-deficient cells but efficient compensation of energetic disadvantage by enhanced anaerobic glycolysis due to low ATP steady state levels // Exp. Cell Res. 2007. 313:3076–3089.

8. McKenzie M. et al. Mitochondrial ND5 gene variation associated with encephalomyopathy and mitochondrial ATP consumption // J. Biol. Chem. 2007. 282:36845–36852.

9. James A.M. et al. Decreased ATP synthesis is phenotypically expressed during increased energy demand in fibroblasts containing mitochondrial tRNA mutations // Eur. J. Biochem. 1999. 259:462–469.

Mitochondria play a key role in the development of most intracellular processes. The genetic regulation of its functioning is determined by nuclear DNA (nDNA) and mitochondrial DNA (mtDNA), which contains the genes of 12S and 16S rRNA, tRNA, and individual polypeptides of the electron transport chain (ETC). mtDNA is characterized by a significantly higher level of mutation [1,2]. According to various estimates, the incidence of diseases associated with mtDNA mutations is about one case per 4000-5000 people [3]. Due to the presence of a large number of mtDNA molecules in the cell (it can reach several thousand), the symptoms of pathologies associated with mutations manifest themselves at the level of heteroplasmy of 60-90% [4, 5]. However, it should be noted that these data were obtained as a result of studies containing a limited (usually one or two) number of mtDNA mutations in the cell. While due to the high frequency of mtDNA damage, cases of a significantly higher level of mutational load are not uncommon. So, various interaction effects are possible. The molecular mechanisms of mtDNA mutations have not been sufficiently studied. The nature of changes in ATP synthesis, mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the content and activity of ETC proteins, ROS production in various studies differs both qualitatively and quantitatively (even when considering the same mutations), which is probably due to both the values of heteroplasmy and the combination of mutations [6-9]. Thus, the development of research of the relationship between complex combinations of mtDNA mutations and various levels of cellular phenotypic changes is very relevant.

In our work we use lines of cybrids based on THP-1 cells and having 5-8 mtDNA mutations in the MT-RNR1, MT-TL1, MT-TL2, MT-CYTB, MT-ND1, MT-ND2, MT-ND5 and MT-ND6 genes with a heteroplasmy range 1%-68%. At this stage, the studies performed include the analysis of a number of parameters characterizing the bioenergetics of cells (the level and mechanism of formation of ΔΨm; mitochondrial content, the ratio of reduced and oxidized forms, as well as the rate of production of NADH and FADH2; the content and rate of ATP consumption; respiration of cells; formation of ROS; mitophagy level).

The results obtained allow us to make a conclusion about a significant effect of the studied mutations on cellular metabolism, even despite the significantly lower levels of heteroplasmy in comparison with those indicated for the presence of single mutations. In particular, mutations of tRNALeu genes turn out to be significant already at 20% content with the simultaneous presence in the cell of cytochrome b mutations (m.14846G>A) or subunits of the ETC complex I (m.5178C>A, m.14459G>A). All lines are characterized by a significant decrease in the level of ATP in the absence of a positive correlation of this parameter with the time of complete exhaustion of the macroerg when blocking the pathways of its biosynthesis. This indicates various causes of energy deficiency – from decreased ATP formation to hyperactivated actively consuming processes. The combinations of mutations presented in the cybrids are associated with a significant level of dissociation of oxidative phosphorylation, which may be a way to reduce the negative effects of ROS hyperproduction both in the MX matrix and the intermembrane space in the dysfunction of ETC complexes. Disorders of complex I associated with mutations of genes of individual proteins, as well as tRNA genes, are not always compensated by an increase in the expression or activity of succinate dehydrogenase encoded by nDNA, which indicates the limited use of complex II substrates as a tool for protecting cells in the presence of mtDNA mutations. A number of cybrids are characterized by an inverse mode of functioning of the complex V of ETC, which allows maintaining the level of ΔΨm due to consumption of ATP at the same time. Despite the revealed violations, some cybrids are characterized by defective mitophagy, leading to the accumulation of non-functional organelles. In some cases, combinations of mutations can lead to an improvement in the parameters characterizing the state of cells, which is observed, in particular, in the presence of mutations m.13513G>A and m.1555A>G in the MT-ND1 and MT-RNR1 genes, respectively.

The work was supported by the grant of the Russian Science Foundation N 22-15-00317.



1. Kim H.R. et al. Mitochondrial DNA aberrations and pathophysiological implications in hematopoietic diseases, chronic inflammatory diseases, and cancers // Ann. Lab. Med. 2015. 35:1–14.

2. Kazak L. et al. Minimizing the damage: Repair pathways keep mitochondrial DNA intact // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012. 13:659–671.

3. Gorman G.S. et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease // Ann. Neurol. 2015. 77:753–759.

4. Haig D. Intracellular evolution of mitochondrial DNA (mtDNA) and the tragedy of the cytoplasmic commons // Bioessays. 2016. 38:549–555

5. Yoneda M. et al. Heteroplasmic mitochondrial tRNA(Lys) mutation and its complementation in MERRF patient-derived mitochondrial transformants // Muscle Nerve Suppl. 1995. 3:95–101.

6. Lee S.R. et al. Mitochondrial DNA, mitochondrial dysfunction, and cardiac manifestations // Front. Biosci. 2017. 22:1177–1194.

7. von Kleist-Retzow J.C. et al. Impaired mitochondrial Ca2+ homeostasis in respiratory chain-deficient cells but efficient compensation of energetic disadvantage by enhanced anaerobic glycolysis due to low ATP steady state levels // Exp. Cell Res. 2007. 313:3076–3089.

8. McKenzie M. et al. Mitochondrial ND5 gene variation associated with encephalomyopathy and mitochondrial ATP consumption // J. Biol. Chem. 2007. 282:36845–36852.

9. James A.M. et al. Decreased ATP synthesis is phenotypically expressed during increased energy demand in fibroblasts containing mitochondrial tRNA mutations // Eur. J. Biochem. 1999. 259:462–469.