В докладе рассмотрена роль внутриклеточного глутатиона в редокс-зависимой регуляции функционирования белков в различных клетках при физиологических и патологических условиях. Трипептид глутатион является основным низкомолекулярным тиолом клеток животных. В норме в клетках преобладает восстановленная форма глутатиона (GSH). Содержание GSH в клетках составляет 5-10 мМ, в то время как концентрация окисленной формы глутатиона (GSSG) в 100 раз ниже. Однако в условиях окислительного стресса соотношение GSH/GSSG может снижаться до 1. Редокс-потенциал данной редокс-пары фактически определяет внутриклеточный редокс-потенциал [1]. Глутатион вовлечен во множество редокс-зависимых процессов, являясь субстратом для глутатион пероксидаз, а также сам непосредственно участвуя в реакциях нейтрализации радикалов и модификации белков. Глутатионилирование белков – присоединение глутатиона к тиоловой группе белка с образованием дисульфидного мостика. Данная редокс-зависимая модификация защищает группы белка от необратимого окисления и способна изменять его функционирование, что играет важную роль при адаптации клеток к различным условиям.



Особенности регуляции функционирования белков глутатионом рассмотрены на примере Na,K-АТФазы, обеспечивающей поддержание трансмембранного градиента натрия и калия, и гемоглобина – основного белка эритроцитов, транспортирующего кислород.

Нами было показано, что каталитическая субъединица Na,K-АТФазы подвергается регуляторному и базальному глутатионилированию [2-4]. Регуляторное глутатионилирование реализуется в ответ на изменение редокс-статуса клеток, при окислительном стрессе и гипоксии, и приводит к ингибированию транспортной активности или изменению рецепторной функции фермента [2,3]. Установлены остатки цистеина, подвергающиеся регуляторному глутатионилированию, и ответственные за изменение транспортной и рецепторной функции белка [3]. При восстановлении нормальных редокс-условий происходит деглутатионилирование регуляторных остатков цистеина, и белок восстанавливает свою функциональность. Показано, что причиной ингибирования Na,K-АТФазы при глутатионилировании является нарушение связывания АТФ. Установлено, что глутатионилирование является причиной ингибирования Na,K-АТФазы при гипоксии и играет важную роль в адаптации клеток к недостатку кислорода, предотвращая истощение клеток по АТФ [2,3]. Выявлено, что индукция глутатионилирования Na,K-АТФазы с помощью производных глутатиона позволяет снизить повреждение клеток и продлить время нормальной сократимости кардиомиоцитов [5]. Нарушение рецепторной функции Na,K-АТФазы к кардиотоническим стероидам [3] связано с тем, что нарушается интерфейс взаимодействия между глутатионилированной Na,K-АТФазой и Src-киназой. Доступность цистеинов для регуляторного глутатионилирования зависит от конформации Na,K-АТФазы [6].



Базальное глутатионилирование Na,K-АТФазы – глутатионилирование остатков цистеина, которые недоступны в нативном ферменте, происходит при синтезе белка и наблюдается при длительном изменении редокс-условий, например, в условиях длительной гипоксии [4]. Найдены остатки цистеина, способные подвергаться базальному глутатионилированию. Роль базального глутатионилирования до конца не ясна, вероятно, оно может изменять стабильность белка и служить своеобразным маркером того, в каких редокс-условиях происходил его синтез.



В случае кислород-транспортирующего белка гемоглобина (Hb) важную роль в регуляции функции белка играет не только глутатионилирование остатков цистеина, но и образование нековалентного комплекса с GSH. Известно, что глутатионилирование приводит к возрастанию сродства Hb к кислороду [7]. Уровень глутатионилирования Hb растет при различных стрессовых воздействиях, и, вероятно, эта модификация является адаптационной, позволяющей частично компенсировать недостаток кислорода при стрессах. Недавно нами было установлено, что Hb способен формировать комплекс с GSH и образование этого комплекса зависит от оксигенации Hb [8]. Оксиформа Hb обладает большим сродством к глутатиону и может связывать четыре молекулы GSH, в то время как дезоксиформа способна связать только две молекулы GSH. Было установлено, что частичная диссоциация GSH от дезокси-Hb лежит в основе наблюдаемого возрастания уровня GSH в эритроцитах в условиях гипоксии [8]. Данное возрастание уровня GSH может играть важную роль в защите эритроцитов от окислительного стресса, развивающегося в тканях при недостатке кислорода. Поскольку в комплексе с GSH возрастает сродство Hb к кислороду, можно полагать, что образование данного комплекса играет также регуляторную роль [8]. Было выявлено, что образование комплекса GSH:Hb приводит к дестабилизации структуры и изменению в гемовой части белка, в то время как глутатионилирование Hb оказывает влияние на вторичную структуру гемоглобина.



Также рассмотрена роль глутатиона в редокс-зависимой регуляции эритроцитов при различных стрессовых воздействиях, в злокачественных клетках, клетках гематоэнцефалического барьера, нейрональных клетках и бактериях.



Полученные данные свидетельствуют о том, что глутатион является важным регулятором редокс-статуса клетки и способен существенно изменять функционирование белков вследствие глутатионилирования белков или путем образования нековалентного комплекса с белками, что играет важную роль в адаптации клеток к внешним воздействиям.



Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-14-00374).



1. Schafer F.Q. and G.R. Buettner, Free Radic. Biol. Med. 2001; 30: 1191–1212.

2. Petrushanko IY. et al. J Biol Chem. 2012; 287(38): 32195-205.

3. Petrushanko IY et al. Redox Biol. 2017; 13: 310-319.

4. Mitkevich VA et al. Oxid Med Cell Longev. 2016: 9092328.

5. Poluektov YM et al. Sci Rep. 2019; 9(1):4872.

6. Poluektov YM et al. Biochem Biophys Res Commun. 2019; 510(1):86-90.

7. Metere A. et al. Antioxidants & redox signaling. 2014; 20 (3): 403-416.

8. Fenk S et al. Redox Biol. 2022; 58:102535.

The report consider the role of intracellular glutathione in the redox-dependent regulation of protein functioning in various cells under physiological and pathological conditions. Tripeptide glutathione is the main low-molecular-weight thiol of animal cells. Normally, the reduced form of glutathione (GSH) predominates in cells. The content of GSH in cells is 5-10 mM, and the concentration of the oxidized form of glutathione (GSSG) is 100 times lower than GSH. However, under conditions of oxidative stress, the GSH/GSSG ratio can decrease to 1. The redox potential of this redox pair determines the intracellular redox potential [1]. Glutathione is involved in many redox-dependent processes, being a substrate for glutathione peroxidases, and also directly participating in the reactions of radical neutralization and protein modification. Glutathionylation of protein is the addition of glutathione to the thiol group of a protein to form a disulfide bridge. This redox-dependent modification protects thiol groups from irreversible oxidation and can change functioning of protein, which plays an important role in cell adaptation to various conditions.



The features of the regulation of the functioning of proteins by glutathione are considered using the Na,K-ATPase, which maintains the transmembrane gradient of sodium and potassium, and hemoglobin, the main protein of erythrocytes that transports oxygen.

We have shown that the catalytic subunit of Na,K-ATPase undergoes regulatory and basal glutathionylation [2–4]. Regulatory glutathionylation is realized in response to changes in the redox status of cells, under oxidative stress and hypoxia, and leads to inhibition of transport activity or changes in the receptor function of the enzyme [2,3]. The regulatory cysteine residues that glutathionylation are responsible for changes in the transport and receptor functions of the protein was found [3]. When normal redox conditions are restored, deglutathionylation of regulatory cysteine residues occurs, and the protein restores its functionality. It has been shown that the cause of inhibition of Na,K-ATPase during glutathionylation is a violation of ATP binding. It has been established that glutathionylation is the cause of inhibition of Na,K-ATPase during hypoxia and plays an important role in cell adaptation to oxygen deficiency, preventing ATP depletion of cells [2,3]. It was found that the induction of Na,K-ATPase glutathionylation using the glutathione derivatives reduces cell damage and prolongs the time of normal contractility of cardiomyocytes [5]. Violation of the receptor function of Na,K-ATPase to cardiotonic steroids under hypoxia [3] is associated with the disruption of the interaction interface between glutathionylated Na,K-ATPase and Src-kinase. The availability of cysteines for regulatory glutathionylation depends on the conformation of Na,K-ATPase [6].



Basal glutathionylation of Na,K-ATPase, i.e., glutathionylation of cysteine residues that are inaccessible in the native enzyme, occurs during protein synthesis and is observed during long-term changes in redox conditions, for example, under conditions of prolonged hypoxia [4]. Cysteine residues capable of undergoing basal glutathionylation have been found. The role of basal glutathionylation is not completely clear. It can probably change the stability of the protein and serve as a kind of marker of the redox conditions under which it was synthesized.



In the case of the oxygen-transporting protein hemoglobin (Hb), both glutathionylation of cysteine reduces and the formation of a non-covalent complex with GSH are played important role. Glutathionylation is known to increase the affinity of Hb for oxygen [7]. The level of Hb glutathionylation increases under various stress conditions, and this modification is probably adaptive and makes it possible to partially compensate for the lack of oxygen during stress. Recently, we found that Hb is able to form the non-covalent complex with GSH, the formation of this complex depends on Hb oxygenation [8]. The oxy-Hb has a high affinity for glutathione and can bind four GSH molecules, while the deoxy-Hb has only two GSH molecules. It was found that partial dissociation of GSH from deoxy-Hb underlies the observed increase in the level of GSH in erythrocytes under hypoxic conditions [8]. This increase in GSH levels can play an important role in protecting erythrocytes from oxidative stress that develops in tissues with a lack of oxygen. Since the affinity of Hb for oxygen increases in the complex with GSH, it can be assumed that the formation of this complex also play a regulatory role [8].

It was found that the formation of the GSH:Hb complex leads to structural destabilization and changes in the heme part of the protein, while Hb glutathionylation affects the secondary structure of hemoglobin.



It was also considered the role of glutathione in the redox-dependent regulation of erythrocytes under various stress conditions, in malignant cells, blood-brain barrier cells, neuronal cells, and bacteria.



The obtained data indicate that glutathione is an important regulator of the cell redox status and can significantly change the functioning of proteins due to protein glutathionylation or by forming a non-covalent complex with proteins, which plays an important role in cell adaptation to external influences.



This research was funded by Russian Science Foundation (Grant No. # 19-14-00374).



1. Schafer F.Q. and G.R. Buettner, Free Radic. Biol. Med. 2001; 30: 1191–1212.

2. Petrushanko IY. et al. J Biol Chem. 2012; 287(38): 32195-205.

3. Petrushanko IY et al. Redox Biol. 2017; 13: 310-319.

4. Mitkevich VA et al. Oxid Med Cell Longev. 2016 :9092328.

5. Poluektov YM et al. Sci Rep. 2019; 9(1):4872.

6. Poluektov YM et al. Biochem Biophys Res Commun. 2019; 510(1):86-90.

7. Metere A. et al. Antioxidants & redox signaling. 2014; 20 (3): 403-416.

8. Fenk S et al. Redox Biol. 2022; 58:102535.