Состояние эритроцитов имеет критическое значение для жизнеспособности всего организма. Время жизни и функциональная активность эритроцитов определяется условиями их формирования в костном мозге и уровнем стресса, которому они подвергаются в течение своей жизни. Задачи оценки характера стрессового воздействия, разработки методов снижения повреждения красных кровяных телец в условиях стресса и продления их жизни крайне актуальны. Решение позволит увеличить срок хранения донорской крови, бороться с состояниями анемии, а также увеличить продолжительность жизни человека. Сегодня очевидно, что старение эритроцитов, изменение их свойств тесно связаны с редокс-статусом клеток, который зависит от соотношения восстановленных и окисленных форм молекул. Окисление белковых молекул, в первую очередь, гемоглобина (Гб) – это ключевой фактор повреждения и, как следствие, преждевременного старения эритроцитов. Глутатионилирование гемоглобина - присоединение глутатиона через дисульфидный мостик к тиоловой группе белка, приводит к возрастанию сродства гемоглобина к кислороду, что может вносить вклад в адаптацию клеток к разным стрессовым условиям.



Цель нашей работы – оценить редокс-статус эритроцитов при характерных стрессовых воздействиях и установить роль Гб и его глутатионилирования в этих процессах.

Мы инициировали стрессовые состояния, типичные для эритроцитов, циркулирующих в кровотоке – гипоксию (недостаток O2 в среде), механический, гипоосмотический и метаболический стресс. Для оценки изменения редокс-параметров клеток использовали метод проточной цитометрии [1]. Фиксировали параметры малоуглового и бокового светорассеяния, характеризующих, соответственно, размер и гранулярность/форму клеток. С помощью флуоресцентных красителей характеризовали внутриклеточное содержание глутатиона (GSH), активных форм кислорода (АФК), NO, а также уровень Ca2+. Уровень GSH в лизатах эритроцитов также оценивали с помощью реактива Эллмана – DTNB – 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) [2]. Для оценки степени глутатионилирования Гб использовали метод вестерн-блоттинга.



В условиях гипоксии – снижения парциального давления кислорода до 1% – быстрее всего на изменение уровня кислорода реагирует уровень внутриклеточного Ca2+. Изменение Ca2+играет важную сигнальную роль, после чего происходит изменение параметров, характеризующих редокс-статус эритроцитов: уровня АФК, NO и внутриклеточного глутатиона. Через три часа инкубации эритроцитов в условиях гипоксии наблюдается существенное возрастание уровня NO и GSH, происходящее на фоне снижения уровня АФК. Увеличение содержания NO связано с синтезом de novo через запуск Ca2+-зависимых NO-синтаз [3]. В свою очередь, как мы показали, возрастание уровня GSH обусловлено не синтезом, а выходом молекул глутатиона из нековалентного комплекса с Гб [4]. В условиях гипоксии степень глутатионилирования Гб практически не меняется.



Механический стресс, возникающий in vivo при прохождении эритроцитов через узкий просвет малых капилляров, моделировали пропуская клетки через колонку из смеси α- и микро-целлюлозы [5]. Механическое воздействие приводит к развитию значительного окислительного стресса – росту уровня АФК, NO, снижению внутриклеточного GSH на фоне пониженного содержания Ca2+. Клетки сжимаются, при этом форма клеток значительно не меняется. Наблюдается существенное возрастание уровня глутатионилирования Гб, что обусловлено развитием окислительного стресса.



Острый осмотический стресс, вызванный снижением осмолярности с 330 до 220 мОсм приводит к возрастанию внутриклеточного Ca2+, при этом уровень NO не меняется. Снижение GSH и рост АФК в этом случае менее выражены, чем при механическом стрессе и при этом наблюдается небольшое снижение глутатионилирования Гб. Через 24 часа инкубации практически все внутриклеточные параметры возвращаются к норме и уровень глутатионилирования Гб соответствует контролю. Таким образом, с течением времени происходит адаптация клеток к гипоосмотическому стрессу.



Метаболический стресс индуцировали 24-часовой инкубацией эритроцитов в безглюкозной среде. Размер клеток увеличивается, вероятно, в результате нарушения работы ионных насосов вследствие дефицита АТФ. Снижается содержание GSH на фоне отсутствия роста АФК, что может быть связано с недостатком НАДФ-H, необходимого для восстановления GSSG глутатионредуктазой, а также прекращением синтеза GSH de novo. Кроме того, дефицит НАДФ-H нарушает работу NO синтаз, что может быть причиной снижения уровня NO. Метаболический стресс вызывает существенное увеличение глутатионилирования гемоглобина, что, по-видимому, обусловлено снижением уровня GSH и накоплением GSSG.



Таким образом, возрастание глутатионилирования Гб при стрессовых воздействиях может быть индуцировано развитием окислительного стресса или недостатком АТФ. Продолжение исследований позволит раскрыть молекулярные механизмы клеточной защиты и адаптации эритроцитов к стрессу и предложить в дальнейшем механизмы защиты от преждевременного старения клеток.



Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-14-00374).



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mitkevich V.A. et al. Ribonuclease binase apoptotic signature in leukemic Kasumi-1 cells // Biochimie. 2013. Vol. 95, № 6. P. 1344–1349.

2. Ellman G., Lysko H. A precise method for the determination of whole blood and plasma sulfhydryl groups // Analytical biochemistry. 1979. V. 93. P. 98-102.

3. Ulker, P. et al. Shear stress activation of nitric oxide synthase and increased nitric oxide levels in human red blood cells // Nitric Oxide. 2011. V. 24. №. 4. P. 184-191.

4. Fenk, S. et al. Hemoglobin is an oxygen-dependent glutathione buffer adapting the intracellular reduced glutathione levels to oxygen availability // Redox Biology. 2022. V. 58. P. 102535.

5. Minetti, G. et al. Membrane rearrangements in the maturation of circulating human reticulocytes // Frontiers in physiology. 2020. V. 11. P. 215.

The condition of red blood cells is critical to the vitality of the entire organism. The lifetime and functional activity of red blood cells is determined by the conditions of their formation in the bone marrow and the level of stress to which they are exposed during their life. Assessing the nature of stress exposure and developing methods to reduce damage to red blood cells under stress and prolong their life are highly relevant. The solution will allow for increasing the shelf life of donor blood, better treatment of pathological conditions (anemia) as well as increasing human lifespan. Today it is obvious that the aging of red blood cells and changes in their functional properties are closely related to the redox state of cells, which depends on the ratio of reduced and oxidized forms of molecules. Oxidation of protein molecules, primarily hemoglobin (Hb), is a key factor of damage and, consequently, premature aging of erythrocytes. Glutathionylation of hemoglobin is the attachment of glutathione through a disulfide bridge to the thiol group of protein. It leads to the increasing affinity of hemoglobin for oxygen, which can contribute to the adaptation of cells to various stress conditions.

The aim of our work was to characterize the redox state of red blood cells under physiological stress influences and establish the role of Hb and its glutathionylation in these processes.

We initiated stress conditions typical for erythrocytes circulating in the bloodstream - hypoxia, mechanical, hypoosmotic, and metabolic stress. Flow cytometry method was used to assess the changes in the redox parameters of cells [1]. The parameters of forward-scatter and side-scatter were recorded, reflecting, respectively, changes in the size and shape of cells. The intracellular content of free glutathione (GSH), reactive oxygen species (ROS), NO, and Ca2+ was characterized. We also assessed the level of GSH in erythrocyte lysates using Ellman's reagent - 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) - DTNB [2]. Western blotting method was used to assess the glutathionylation of Hb.

Under hypoxia conditions (oxygen partial pressure decrease up to 1%) change in the intracellular Ca2+ has occurred first. Changes in Ca2+ play an important signaling role, followed by changes in parameters characterizing the redox state of red blood cells: ROS, NO, and intracellular glutathione levels.



After three hours of incubation under hypoxic conditions, there is a significant increase in NO and GSH levels, and a decrease in ROS. The increase in NO content is associated with de novo synthesis through the triggering of Ca2+-dependent NO synthases [3]. On the other hand, the increase in GSH level is caused by the release of glutathione molecules from the noncovalent complex with GB [4]. Under hypoxic conditions glutathionylation of Hb does not change.



Mechanical stress arising in vivo during the passage of erythrocytes through the small capillaries was modeled by passing cells through a column of a mixture of α- and micro-cellulose [5]. Mechanical stress leads to the development of significant oxidative stress - an increase in the level of ROS, NO, decrease in intracellular GSH and Ca2+. The cells shrink, while the shape of the cells does not change significantly. There is a great increase in glutathionylation of Hb due to the development of oxidative stress.



Acute osmotic stress caused by a decrease in osmolarity from 330 to 220 mOsm leads to an increase in intracellular Ca2+, while NO levels do not change. The decrease in GSH and the increase in ROS, in this case, is less pronounced than under mechanical stress and causes a slight decrease in glutathionylation of Hb. After 24 hours of incubation, almost all intracellular parameters return to normal and the level of glutathionylation corresponds to the control group. Thus, over time, the erythrocytes adapt to hypoosmotic stress.



Metabolic stress was induced by 24-hour incubation of red blood cells in the glucose-free buffer. Cell size increases, probably as a result of disruption of ion pumps due to ATP deficiency. GSH content decreases against the background of the absence of ROS growth, which may be due to the lack of NADP-H required for GSSG reduction by glutathione reductase, as well as to the termination of GSH de novo synthesis. In addition, a deficiency of NADP-H, required for NO synthase function, may be responsible for the decrease in NO levels. Metabolic stress causes a significant increase in Hb glutathionylation. This is due to a decrease in GSH levels and an accumulation of GSSG.



Thus, an increase in Hb glutathionylation under stressful conditions can be induced by oxidative stress or lack of ATP. Continued research will allow to reveal the molecular mechanisms of cellular defense and adaptation of erythrocytes to stress and in the future to suggest of defence from processes of red blood cell aging.



This work was supported by the Russian Science Foundation, grant #19-14-00374.



REFERENCES

1. Mitkevich V.A. et al. Ribonuclease binase apoptotic signature in leukemic Kasumi-1 cells // Biochimie. 2013. Vol. 95, № 6. P. 1344–1349.

2. Ellman G., Lysko H. A precise method for the determination of whole blood and plasma sulfhydryl groups // Analytical biochemistry. 1979. V. 93. P. 98-102.

3. Ulker, P. et al. Shear stress activation of nitric oxide synthase and increased nitric oxide levels in human red blood cells // Nitric Oxide. 2011. V. 24. №. 4. P. 184-191.

4. Fenk, S. et al. Hemoglobin is an oxygen-dependent glutathione buffer adapting the intracellular reduced glutathione levels to oxygen availability // Redox Biology. 2022. V. 58. P. 102535.

5. Minetti, G. et al. Membrane rearrangements in the maturation of circulating human reticulocytes // Frontiers in physiology. 2020. V. 11. P. 215.