Comet assay (Комета-тест) лучший тест, широко используемый для демонстрации отсутствия повреждений в молекуле ДНК. Он считается отличным инструментом скрининга для выявления повреждений ДНК, что имеет большое практическое значение. Несмотря на высокую применимость этого метода, наблюдается большая вариабельность и низкая сходимость результатов в рамках различных экспериментальных исследований проводимых как в рамках одной так и в межлаботаторных работах, что затрудняет сравнение исследований. Считалось что это результат использование разных протоколов. Однако уже были проведены ряд исследований по согласованным протоколам для выяснению причин вариабельности в межлабораторных результатах (1,2,3)

В этих исследованиях было показано, что на результаты комета теста могут влиять концентрация агарозы, плотность образующихся комет, длительность щелочного периода инкубации нуклеоидов перед электрофорезом, рН буферного раствора для электрофореза и время лизиса (4).

В литературе нет данных по исследованиям взаимодействия легкоплавкой агарозы с внутриклеточным генетическим материалом. Мы обнаружили, что при приготовлении препаратов с клетками, иммобилизованными в легкоплавкую агарозу, происходит проникновение агарозы внутрь клеточного ядра, где происходит ее стерическое взаимодействие с цепями геномной ДНК. При желирования агарозы образуются спиралевидные структуры в виде тяжей из нескольких молекул агарозы (5). Возникает структура с напряженностью вдоль сформировавшихся альфа спиралей в таких нитях. Дополнительная напряженность может возникать в процессе растекания капли агарозы под действие тяжести покровного стекла при формировании препарата. В процессе лизиса клеток происходит дезинтеграция клеточных и ядерных мембран и депротеинизация молекул геномной ДНК.

После завершения лизиса напряженность в альфа спиралях приводит к сокращению агарозных нитей. И как следствие на препарате наблюдается перемещение двуцепочечной ДНК стерически замкнутой c агарозными нитями. Анализ препаратов подвергнутых окрашиванию бромистым этидием (интеркалятором в двуцепочечную ДНК) под флуоресцентным микроскопом показал наличие ДНК-комет с хвостами ориентированными в соответствии с направлением потока легкоплавкой агарозы.

Обработка препаратов (после лизиса и окрашивания) ДНказой 1 продемонстрировали что в структуре хвостов ДНК-комет присутствует именно ДНК. Аналогичные изображения наблюдались на препаратах с клетками асцитной карциномы Эрлиха, изолированными сплееноцитами мышей и клетками карциномы молочной железы мыши EMT6/P .



Литература:

1.Evaluation of the Major Steps in the Conventional Protocol for the Alkaline Comet Assay

Mahsa Karbaschi et.al Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 6072; doi:10.3390/ijms20236072

2. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme modified

comet assay in human biomonitoring studies

Amaya Azquetaa et. al Mutat Res Gen Tox En 843 (2019) 24–32

3. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results Peter Møller et al. NATURE PROTOCOLS | www.nature.com/nprot

4. Calibration o the comet assay using ionising radiation. Gunnar Brunborg et .al Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 885 (2023) 503560

5. Mechanically Tailored Agarose Hydrogels through Molecular Alloying with β-Sheet

Polysaccharides Aurelien Forget Macromol. R

Comet assay (Comet test) is the best test widely used to demonstrate the absence of damage in the DNA molecule. It is considered an excellent screening tool for detecting DNA damage, which is of great practical importance. Despite the high applicability of this method, there is a large variability and low convergence of results in various experimental studies conducted both within the framework of one and in interlabotatory work, which makes it difficult to compare studies. It was believed that this was the result of using different protocols. However, a number of studies have already been conducted using agreed protocols to clarify the causes of variability in the interlaboratory results (1,2,3)

In these studies, it was shown that the results of the comet test can be influenced by the concentration of agarose, the density of comets formed, the duration of the alkaline incubation period of nucleoids before electrophoresis, the pH of the buffer solution for electrophoresis and the lysis time (4).

There is no data in the literature on studies of the interaction of fusible agarose with intracellular genetic material. We found that when preparing preparations with cells immobilized in fusible agarose, agarose penetrates into the cell nucleus, where its steric interaction with genomic DNA chains occurs. When agarose is gelled, spiral structures are formed in the form of strands of several agarose molecules (5). A structure with tension along the formed alpha helices in such strands arises. Additional tension may occur during the spreading of the agarose droplet under the influence of the gravity of the cover glass during the formation of the drug. In the process of cell lysis, cell and nuclear membranes disintegrate and genomic DNA molecules deproteinize.

After the completion of lysis, the tension in the alpha helices leads to a reduction of the agarose filaments. And as a consequence, there is a movement of double-stranded DNA sterically closed with agarose strands on the drug. Analysis of preparations subjected to staining with ethidium bromide (intercalator into double-stranded DNA) under a fluorescent microscope showed the presence of DNA comets with tails oriented in accordance with the direction of flow of fusible agarose.

The treatment of preparations (after lysis and staining) with DNase 1 demonstrated that DNA is present in the structure of the tails of DNA comets. Similar images were observed on preparations with Ehrlich ascitic carcinoma cells, isolated mouse splenocytes and mouse EMT6/P breast carcinoma cells.



Literature: