Рецепторы сигма-1 – повсеместные многофункциональные лигандрегулируемые молекулярные шапероны в мембране эндоплазматического ретикулума, имеющие уникальную историю, структуру и фармакологический профиль. Рецепторы сигма-1 модулируют широкий спектр клеточных процессов в норме и патологии, включая процессы Ca2+-сигнализации.

Для выявления участия рецепторов сигма-1 в процессах Ca2+-сигнализации в макрофагах исследовали влияние антагониста рецепторов сигма-1 нейролептика галоперидола на Са2+-ответы, вызываемые ингибиторами эндоплазматических Са2+-АТФаз тапсигаргином (ТГ) и циклопьязониковой кислотой (ЦПК), а также дисульфидсодержащими иммуномодуляторами глутоксимом® (динатриевая соль окисленного глутатиона с d-металлом в наноконцентрации, ФАРМА-ВАМ, Санкт-Петербург) и моликсаном® (комплекс глутоксима и нуклеозида инозина, ФАРМА-ВАМ) в перитонеальных макрофагах крысы.

Эксперименты проводили на культивируемых резидентных перитонеальных макрофагах крыс линии Wistar на автоматизированной установке для измерения внутриклеточной концентрации Са2+, [Ca2+]i, на базе флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000B (Leica Microsystems, Германия). Для измерения [Ca2+]i использовали флуоресцентный зонд Fura-2AM. Статистический анализ проводили с применением критерия t Стьюдента. Достоверными считали различия при p ≤ 0.05.

Влияние галоперидола на Са2+-ответы, индуцируемые ингибиторами эндоплазматических Са2+-АТФаз. В контрольных экспериментах обнаружили, что добавление 0.5 мкМ ТГ к макрофагам, находящимся в бескальциевой среде, вызывает незначительное увеличение [Ca2+]i, отражающее мобилизацию Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо. В среднем увеличение [Ca2+]i во время фазы мобилизации составило 31 ± 9 нМ (n = 7; p < 0.05). При последующем введении в наружную среду 2 мМ Са2+ наблюдали депозависимый вход Са2+ в цитозоль. В среднем увеличение [Ca2+]i во время входа Са2+ составило 152 ± 20 нМ (n = 7; p < 0.05). Сходные результаты мы получили при использовании 10 мкМ ЦПК. В среднем увеличение [Ca2+]i во время фазы мобилизации Са2+ из депо, вызываемой ЦПК, составило 26 ± 9 нМ (n = 7; p < 0.05), а во время входа Са2+ в макрофаги – 141 ± 22 нМ (n = 7; p < 0.05).

Показано, что преинкубация макрофагов с 30 мкг/мл галоперидола в течение 20 мин до введения 0.5 мкМ ТГ вызывала подавление обеих фаз Са2+-ответа, индуцируемого ТГ. В среднем галоперидол подавлял фазу мобилизации Са2+ из депо на 23.2 ± 7.9 % (n = 7; p < 0.05), а последующий депозависимый вход Са2+ в макрофаги – на 42.3 ± 13.6 % (n = 7; p < 0.05). Сходные результаты были получены в опытах с применением 10 мкМ ЦПК. В среднем галоперидол вызывал подавление мобилизации Са2+ из депо на 25.9 ± 8.0 % (n = 7; p < 0.05) и подавление входа Са2+ на 43.8 ± 12.5 % (n = 7; p < 0.05), индуцируемых ЦПК. Это свидетельствует об участии рецепторов сигма-1 в активации депозависимого входа Са2+, индуцируемого ТГ или ЦПК в макрофагах.

Кроме того, обнаружено, что добавление 30 мкг/мл галоперидола на фоне развившегося входа Са2+, индуцированного ТГ или ЦПК, вызывает значительное подавление депозависимого входа Са2+ в макрофаги. Так, подавление входа Са2+ составило: 48.5 ± 17.1 % (n = 7; p < 0.05) для ТГ и 48.1 ± 16.9 % (n = 7; p < 0.05) для ЦПК. Это свидетельствует об участии рецепторов сигма-1 не только в активации, но и в поддержании депозависимого входа Са2+ в макрофаги.

Влияние галоперидола на Са2+-ответы, вызываемые глутоксимом и моликсаном в макрофагах. В контрольных экспериментах было показано, что инкубация макрофагов в течение 20 мин со 100 мкг/мл глутоксима или 100 мкг/мл моликсана в бескальциевой среде вызывает медленно нарастающее увеличение [Ca2+]i, отражающее мобилизацию Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо. Через 20 мин после добавления агентов [Ca2+]i в среднем увеличивалась от базального уровня, равного 90 ± 18, до 135 ± 18 нМ (n = 7; p < 0.05) для глутоксима и 134 ± 20 нМ (n = 6; p < 0.05) для моликсана. При введении в наружную среду 2 мМ Са2+ наблюдали дальнейшее повышение [Ca2+]i, отражающее депозависимый вход Са2+ в цитозоль. В среднем увеличение [Ca2+]i во время входа Са2+ составило 223 ± 22 нМ (n = 7; p < 0.05) и 202 ± 20 нМ (n = 6; p < 0.05) для глутоксима и моликсана соответственно.

Обнаружено, что преинкубация макрофагов с 30 мкг/мл галоперидола в течение 6 мин до введения 100 мкг/мл глутоксима приводила к значительному подавлению как мобилизации Са2+ из депо (на 50.3 ± 8.4%, n = 7; p < 0.05), так и последующего депозависимого входа Са2+ в клетку (на 54.5 ± 9.5%, n = 7, p < 0.05), индуцируемых глутоксимом. Сходные данные были получены в опытах по влиянию 30 мкг/мл галоперидола на Са2+-ответы, вызываемые 100 мкг/мл моликсана. В среднем галоперидол вызывал подавление мобилизации Са2+ из депо на 49.3 % (n = 7; p < 0.05) и подавление входа Са2+ в клетки на 47.6 % (n = 7; p < 0.05), индуцируемых моликсаном. Это свидетельствует об участии рецепторов сигма-1 в активации депозависимого входа Са2+, индуцируемого глутоксимом или моликсаном, в макрофагах. Кроме того, выявлено, что добавление 50 мкг/мл галоперидола на фоне развившегося входа Са2+, индуцированного глутоксимом или моликсаном, вызывает значительное (на 51.4 ± 9.0 %, n = 12; p < 0.05) подавление депозависимого входа Са2+ в макрофаги.

Таким образом, мы впервые на перитонеальных макрофагах крысы показали, что антагонист рецепторов сигма-1 нейролептик галоперидол значительно подавляет обе фазы Са2+-ответов, вызываемых иммуномодуляторами глутоксимом и моликсаном, а также ингибиторами эндоплазматических Са2+-АТФаз ТГ и ЦПК, в перитонеальных макрофагах. Полученные данные свидетельствуют о возможном участии рецепторов сигма-1 в комплексном сигнальном каскаде, вызываемом глутоксимом или моликсаном и приводящем к увеличению [Ca2+]i, в макрофагах, а также об участии рецепторов сигма-1 в регуляции депозависимого входа Са2+ в макрофагах. Результаты указывают также на нежелательность совместного применения в клинической практике препаратов глутоксим или моликсан и нейролептика галоперидола.

Sigma-1 receptors are ubiquitous multifunctional ligand-regulated molecular chaperones in endoplasmic reticulum membrane with a unique history, structure, and pharmacological profile. Sigma-1 receptors modulate a wide range of cellular processes in health and disease, including Ca2+ signaling.

To elucidate the involvement of sigma-1 receptors in Ca2+ signaling processes in macrophages, we studied the effect of sigma-1 receptor antagonist neuroleptic haloperidol on Ca2+ responses induced by endoplasmic Ca2+-ATPase inhibitors thapsigargin (TG) and cyclopiazonic acid (CPA), as well as disulfide-containing immunomodulators glutoxim® (disodium salt of oxidized glutathione with d-metal at nanoconcentration, PHARMA-VAM, St. Petersburg) and molixan® (complex of glutoxim and inosine nucleoside, PHARMA-VAM) in rat peritoneal macrophages.

The experiments were carried out on cultured resident peritoneal macrophages of Wistar rats using an automated setup for measuring the intracellular Ca2+ concentration, [Ca2+]i, based on Leica DM 4000B fluorescent microscope (Leica Microsystems, Germany). [Ca2+]i was measured using Fura-2AM fluorescent probe. Statistical analysis was performed using Student's t test. Differences were considered significant at p ≤ 0.05.

The effect of haloperidol on Ca2+ responses induced by endoplasmic Ca2+-ATPase inhibitors. In control experiments, it was found that the addition of 0.5 μM TG to macrophages in a calcium-free medium causes a slight increase in [Ca2+]i, reflecting Ca2+ mobilization from intracellular Ca2+ stores. The average increase in [Ca2+]i during the mobilization phase was 31 ± 9 nM (n = 7; p < 0.05). With the subsequent addition of 2 mM Ca2+ into the external medium, store-dependent Ca2+ entry into the cytosol was observed. On average, the increase in [Ca2+]i during Ca2+ entry was 152 ± 20 nM (n = 7; p < 0.05). Similar results were obtained using 10 μM CPA. On average, the [Ca2+]i increase during Ca2+ mobilization phase, induced by CPA, was 26 ± 9 nM (n = 7; p < 0.05), and during Ca2+entry phase it was 141 ± 22 nM (n = 7; p < 0.05).

It was shown that macrophage preincubation with 30 µg/mL haloperidol for 20 min prior to the addition of 0.5 µM TG resulted in suppression of both phases of TG-induced Ca2+ response. On average, haloperidol suppressed Ca2+ mobilization phase by 23.2 ± 7.9% (n = 7; p < 0.05), and the subsequent store-dependent Ca2+entry - by 42.3 ± 13.6% (n = 7; p < 0.05). Similar results were obtained using 10 μM CPA. On average, haloperidol suppressed Ca2+ mobilization from the stores by 25.9 ± 8.0% (n = 7; p < 0.05) and suppressed store-dependent Ca2+ entry by 43.8 ± 12.5% (n = 7; p < 0.05), induced by CPA. This indicates the involvement of sigma-1 receptors in the activation of store-dependent Ca2+ entry induced by TG or CPA in macrophages.

It was also found that the addition of 30 µg/mL haloperidol against the background of the developed Ca2+ entry, induced by TG or CPA, causes a significant suppression of store-dependent Ca2+ entry into macrophages. Thus, the suppression of Ca2+ entry was 48.5 ± 17.1% (n = 7; p < 0.05) for TG and 48.1 ± 16.9% (n = 7; p < 0.05) for CPA. This suggests the involvement of sigma-1 receptors not only in activation, but also in maintenance of store-dependent Ca2+ entry into macrophages.

The effect of haloperidol on Ca2+ responses induced by glutoxim and molixan in macrophages. In control experiments, it was shown that macrophage incubation for 20 min with 100 μg/mL glutoxim or 100 μg/mL molixan in calcium-free medium causes a slowly increasing [Ca2+]i increase, reflecting Ca2+ mobilization from intracellular Ca2+ stores. 20 min after the addition of agents, [Ca2+]i increased on average from a baseline level of 90 ± 18 to 135 ± 18 nM (n = 7; p < 0.05) for glutoxim and 134 ± 20 nM (n = 6; p < 0.05) for molixan. When 2 mM Ca2+ was introduced into the external medium, a further [Ca2+]i increase was observed, reflecting store-dependent Ca2+ entry into the cytosol. On average, the [Ca2+]i increase during Ca2+ entry was 223 ± 22 nM (n = 7; p < 0.05) and 202 ± 20 nM (n = 6; p < 0.05) for glutoxim and molixan, respectively.

It was found that macrophage preincubation with 30 µg/mL haloperidol for 6 min prior to addition of 100 µg/mL glutoxim resulted in a significant suppression of both Ca2+ mobilization from the stores (by 50.3 ± 8.4%, n = 7; p < 0.05) and subsequent store-dependent Ca2+ entry into the cell (by 54.5 ± 9.5%, n = 7, p < 0.05), induced by glutoxim. Similar data were obtained in experiments on the effect of 30 μg/mL haloperidol on Ca2+ responses elicited by 100 μg/mL molixan. On average, haloperidol caused suppression of Ca2+ mobilization from the stores by 49.3% (n = 7; p < 0.05) and suppression of Ca2+ entry into the cell by 47.6% (n = 7; p < 0.05), induced by molixan. This indicates the involvement of sigma-1 receptors in the activation of store-dependent Ca2+ entry, induced by glutoxim or molixan, in macrophages. It was also found that the addition of 50 μg/mL haloperidol against the background of the developed Ca2+ entry, induced by glutoxim or molixan, causes a significant (by 51.4 ± 9.0%, n = 12; p < 0.05) suppression of store-dependent Ca2+ entry into macrophages.

Thus, we have shown for the first time on rat peritoneal macrophages that sigma-1 receptor antagonist neuroleptic haloperidol significantly suppresses both phases of Ca2+ responses induced by immunomodulators glutoxim and molixan, as well as endoplasmic Ca2+-ATPase inhibitors, TG and CPA, in peritoneal macrophages. The data obtained indicate the involvement of sigma-1 receptors in complex signaling cascade induced by glutoxim or molixan and leading to [Ca2+]i increase in macrophages, as well as sigma-1 receptors participation in store-dependent Ca2+ entry regulation in macrophages. The results also indicate that the combined use of glutoxim or molixan and the neuroleptic haloperidol in clinical practice is undesirable.