VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Биофизика клетки. Мембранные и транспортные процессы

Секреция нейромедиаторов во вкусовой почке

О.А. Рогачевская1*, А.П. Черкашин1, А.А. Хохлов1, С.С. Колесников1

1.ИБК РАН - ФИЦ ПНЦБИ РАН;

* o.rogachevskaja(at)gmail.com

За первый этап формирования вкусовых ощущений, передающих информацию о качестве и ценности пищи, отвечают вкусовые рецепторные клетки, контактирующие с веществами, растворенными в слюне. Вкусовые клетки сгруппированы в плотные ассоциаты – вкусовые почки, и по морфофункциональным критериям подразделяются на четыре типа: зрелые веретенообразные рецепторные клетки типа I – III, апикальная мембрана которых достигает вкусовой поры, и базально расположенные незрелые клетки (IV тип). В клетках типа II («истинно» рецепторные клетки, экспрессирующие рецепторы горького, сладкого, умами и другие компоненты цепи вкусовой трансдукции) функционирует неканонический безвезикулярный химический синапс, где нейротрансмиттер АТФ секретируется через каналы кальций-независимым образом. Клетку типа II и примыкающее нервное окончание окружает астроцитоподобная клетка типа I, формируя межклеточный компартмент, подобный синаптической щели. Считается, что вкусовые клетки типа I детектируют соленое и через генерацию потенциала действия непосредственно активируют прилежащее нервное окончание. Клетки типа III (опосредуют кислый и, возможно, некоторые соленые стимулы), называемые еще «синаптическими», единственные во вкусовой почке формируют классические химические синапсы с нервными окончаниями и в ответ на вкусовую стимуляцию квантово высвобождают серотонин кальций-зависимым образом. Таким образом, клетки типа II и III полученную информацию о вкусовом стимуле преобразуют в секрецию нейромедиаторов (АТФ и серотонина преимущественно), активирующих афферентные нервные окончания.

Поскольку зачастую в физиологических экспериментах in vitro требуется регистрация выброса нейромедиатора из отдельной вкусовой клетки, что приводит к необходимости детектировать наномолярные концентрации нейромедиатора в локальном объеме экспериментальной камеры, одним из основных подходов, используемых при исследовании вкусовой рецепции, является метод клеток-сенсоров, экспрессирующих рецептор секретируемой молекулы и генерирующих клеточный ответ на появление нейромедиатора.

В частности, для изучения регуляции секреции серотонина во вкусовых клетках типа III, нами был создан сенсор серотонина на базе клеток СНО и 5-НТ2С рецептора, сопряженного с системой мобилизации внутриклеточного кальция, что позволило регистрировать его сигналы с помощью Са2+-зондов и микрофотометрии. Однако, полученный биосенсор генерировал Са2+ сигналы по принципу «все-или-ничего», что демонстрировало лишь сам факт секреции нейромедиатора. Для получения количественной информации нами был создан градуальный сенсор серотонина на основе клеток НЕК293, серотонинового рецептора типа 5-НТ4, сопряженного с аденилатциклазным каскадом, и генетически кодируемого цАМФ-сенсора (флуоресцентный белок Pink Flamindo), что дало возможность детально изучить механизмы регуляции секреции серотонина из вкусовых клеток типа III.

Клетки СНО, экспрессирующие гетеродимерный ионный канал Р2Х2/Р2Х3, и клетки COS, экспрессирующие эндогенные P2Y рецепторы, использовались в качестве сенсоров при изучении секреции АТФ, что позволило нам не только впервые продемонстрировать факт секреции АТФ вкусовыми клетками типа II, но и детально изучить его механизмы.

Вкусовая стимуляция клеток типа III не приводила к генерации ответов клетками-сенсорами АТФ, однако используя флуоресцентный краситель куинакрин, который специфически окрашивает АТФ-содержащие везикулы в цитоплазме клеток, и конфокальный микроскоп, мы показали, что в ответ на деполяризацию клеток типа III наблюдалось уменьшение везикуло-подобных структур у базальной мембраны, что может рассматриваться как свидетельство экзоцитоза АТФ в качестве нейротрансмиттера этими вкусовыми клетками.

При использовании метода биосенсоров для исследования стимул-зависимой секреции нейромедиаторов, практически невозможно стимулировать только апикальную мембрану клеток, и существует вероятность регистрации неспецифических эффектов вкусовых соединений. Поэтому для on-line мониторинга секреции АТФ в условиях физиологически адекватной стимуляции нами была разработана уникальная методика на основе подхода Уссинга и люциферин-люциферазного метода. Для этого фрагмент языкового эпителия, содержащего желобоватый вкусовой сосочек, закреплялся в модифицированной камере Уссинга, которая за счёт физической изоляции апикальной и базолатеральной частей позволила стимулировать отдельно апикальную часть вкусовых клеток, экспонированную в верхнюю ячейку камеры, и детектировать АТФ, секретирующийся из базальной части эпителия в нижнюю ячейку камеры, заполненную смесью люциферин-люциферазы. Эта методика позволила визуализовать выброс ATФ языковым эпителием ex vivo в ответ на стимуляцию вкусовыми веществами при сохранении жизнеспособности вкусовой ткани и ее способности отвечать на горькие вещества в течении нескольких часов.

Описанные подходы существенно расширяют инструментарий, используемый при изучении секреции нейромедиаторов, и могут использоваться для разных типов клеток.

Работа поддержана грантом РНФ №22-14-00031.

Neurotransmitters secretion in the taste bud

O.A. Rogachevskaya1*, A.P. Cherkashin1, A.A. Khokhlov1, S.S. Kolesnikov1

1.Institute of Cell Biophysics of RAS;

* o.rogachevskaja(at)gmail.com

The first stage in the formation of taste sensations that convey information about the quality and value of food is the responsibility of taste receptor cells that come into contact with substances dissolved in saliva. Taste cells are grouped into dense associates - taste buds, and according to morphological and functional criteria are divided into four types: basally-situated, immature type IV cells, and 3 types (I-III) of mature elongate receptor cells, which apical membrane reaches the taste pore. In type II cells (or "receptor" cells, since they express bitter, sweet, and umami receptors along with other components of the taste transduction), a non-canonical vesicular-free chemical synapse functions, where the neurotransmitter ATP is secreted through channels in a calcium-independent manner. The type II cell and adjacent nerve ending are surrounded by an astrocyte-like type I cell, forming an intercellular compartment similar to the synaptic cleft. It is supposed that type I taste cells detect salty and, through the generation of an action potential, directly activate the adjacent nerve ending. Type III cells (mediate sour and possibly some salty taste), aka "synaptic cells", are the only cells that form classical chemical synapses with nerve endings, quantumly releasing serotonin in a calcium-dependent manner in response to taste stimulation. Thus, type II and III cells convert the received information about the taste stimulus into the secretion of neurotransmitters (ATP and serotonin mainly) that activate nerve endings.

Since in vitro physiological experiments often require registration of the neurotransmitters release from a single taste cell, which means the need to detect nanomolar concentrations of the neurotransmitter in a local area of the experimental chamber, one of the main approaches used in the study of taste reception is the method of sensor cells expressing the receptor of the secreted molecule and generating a cellular response to the appearance of a neurotransmitter.

In particular, to study the regulation of serotonin secretion in type III taste cells, we created a serotonin sensor based on CHO cells and a 5-HT2C receptor coupled to the intracellular calcium mobilization system, which makes it possible to record its signals using Ca2+-probes and microphotometry. However, the resulting biosensor generated Ca2+ signals according to the “all-or-nothing” principle, which can only display the fact of neurotransmitter secretion, but not its quantity. Therefore, we created a serotonin sensor based on HEK293 cells, 5-HT4 serotonin receptor coupled to the adenylyl cyclase cascade, genetically encoded cAMP-sensor, fluorescent protein Pink Flamindo. This biosensor had a gradual sensitivity to serotonin, which made it possible to study the mechanisms of regulation of serotonin secretion from type III taste cells.

To study ATP secretion we used CHO cells expressing P2X2/P2X3 heterodimeric ion channel and COS cells expressing endogenous P2Y receptors as ATP-sensors, which allowed us not only to demonstrate the fact of ATP-release by type II taste cells, but also investigate the detailed mechanism of secretion.

Taste stimulation of type III cells did not lead to the generation of responses of ATP sensor cells, however, using a confocal microscope and the fluorescent dye quinacrine, which specifically stains ATP-containing vesicles in the cells, we showed that, in response to depolarization of type III cells, a decrease in vesicular structures at the basement membrane, which can be considered as evidence of the exocytosis of ATP as a neurotransmitter by these taste cells.

Using the biosensor method to study the stimulus-dependent secretion of neurotransmitters, it is almost impossible to stimulate only the apical membrane of cells, and there is always the possibility of non-specific effects of taste compounds. Therefore, for on-line monitoring of ATP secretion, we developed a unique methodology based on the Ussing approach and the luciferin-luciferase method. For this, a fragment of the lingual epithelium containing a grooved taste bud was fixed in a modified Ussing chamber, which, due to the physical isolation of the apical and basolateral parts, made it possible to stimulate the apical part of the gustatory epithelium separately and to detect ATP secreted from the basal part of the epithelium using a mixture of luciferin-luciferase. This technique made it possible to visualize the release of ATP by the lingual epithelium ex vivo in response to stimulation with gustatory substances and preserve the viability of gustatory tissue and its ability to respond to bitter substances for several hours.

The described approaches significantly expand the tools used in the study of neurotransmitter secretion and can be used for different cell types.

The work was supported by the RSF grant No. 22-14-00031.


Докладчик: Рогачевская О.А.
43
2023-02-15

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists