Исследование морфологии эритроцитов при сахарном диабете (СД) в эксперименте и клинике выявляет изменение диаметра и появление клеток аномальной формы в кровотоке. Преимущество метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) заключается в том, что он позволяет получить сведения не только о морфологии клетки, но и о рельефе клеточной поверхности и ее механических свойствах [1, 2]. Выраженность морфологических изменений определяется накоплением структурных повреждений эритроцита в результате метаболических нарушений (гиперосмолярности, активации неферментативного гликирования белков мембраны и цитоскелета, накопления в мембране продуктов перекисного окисления липидов), связанных с гипергликемией [1,2,3]. Наши предыдущие исследования показали возможность коррекции метаболических нарушений при экспериментальном сахарном диабете синтетическими органическими соединениями ряда замещенных 6Н-1,3,4-тиадиазинов, сочетающих антигликирующую и антиоксидантную активность [4]. При поиске новых противодиабетических соединений следует учитывать не только их метаболические эффекты, но и способность корригировать биофизические параметры эритроцита, от которых зависит состояние микроциркуляции и эффективность оксигенации тканей, нарушенных при СД.

Цель работы: оценить морфологические и биофизические параметры эритроцитов периферической крови крыс при экспериментальном СД в условиях его коррекции замещенными 6H-1,3,4-тиадиазинами.

Сахарный диабет у крыс моделировали путем внутрибрюшинного введения аллоксана в суммарной дозе 300 мг/кг массы тела, разделенной на 3 фракции. Животным опытных групп внутримышечно в дозе 40 мг/кг вводили разведенные в воде для инъекций синтетические соединения L-17 и LT-27 из класса замещенных 6Н-1,3,4-тиадиазинов, отличающихся природой заместителя в положениях 2- и 5- гетероцикла. Спустя 4 недели из периферической крови животных готовили мазки на подложке из свежесколотой слюды без применения фиксирующих реагентов. АСМ высушенных препаратов проводилась полуконтактным методом в воздушной среде на микроскопе «Интегра Максимус» (НТ-МДТ), кантилевером марки NSG03 при частоте колебаний 90 кГц. Оценивали морфологию эритроцитов (диаметр, высоту), количественное соотношение нормальных (дискоцитов) и аномальных (сфероцитов, стоматоцитов, эхиноцитов и др.) форм клеток, а также величину адгезии клеточной поверхности.

Эритроциты крыс с аллоксановым СД характеризовались, по сравнению с интактными животными, большими значениями среднего диаметра, соответственно, 9,75±0,20 и 8,8±0,32 мкм, рSt <0,05, и высоты (448,6±19,57 и 377,5±26,33 нм, рSt<0,05), адгезия клеточной поверхности не претерпела статистически значимых изменений (104,5±6,73 и 90,6±19,01 нН). Введение соединения L-17 приводило к уменьшению среднего диаметра эритроцитов статистически значимо ниже значений контрольных и интактных животных (7,9±0,18 мкм, рSt<0,05), средняя высота клеток значимо не изменилась (407,3±21,69 нм), а адгезия возросла до 133,1±18,45 нН, рSt<0,05. На фоне применения соединения LТ-27 средний диаметр эритроцитов также был статистически значимо ниже значений контрольных и интактных животных (7,2±0,27 мкм, рSt<0,05), однако произошло увеличение средней высоты эритроцита до 472,4±35,27 нм, рSt<0,05, и снижение адгезии до 58,2±6,13, рSt<0,05, что свидетельствует об увеличении жесткости поверхности мембраны.

Развитие СД привело к снижению доли эритроцитов нормальной формы (дискоцитов) с 57% до 17%, рχ2<0,001, преобладающей формой клетки был сфероцит (42% против 20% у интактных животных, рχ2<0,001). Введение соединения L-17 приводило к увеличению пойкилоцитоза: дискоциты составили 13%, эхиноциты 29%, сфероциты 23%, стоматоциты 20%, прочие формы 15%, рχ2<0,01. При коррекции СД соединением LT-27 96% эритроцитов составили эхиноциты, рχ2<0,001.

Таким образом, проведенное исследование показало способность соединений ряда 2,5-замещенных 6Н-1,3,4-тиадиазинов изменять морфологические и биофизические параметры эритроцитов крыс при экспериментальном СД. Лучшей корригирующей способностью обладало соединение L-17.

Литература:

1. Loyola-Leyva A., Loyola-Rodríguez J.P., Terán-Figueroa Y., Camacho-Lopez S., González F.J., Barquera S. Application of atomic force microscopy to assess erythrocytes morphology in early stages of diabetes. A pilot study // Micron. 2021 Feb;141:102982. doi: 10.1016/j.micron.2020.102982.

2. S AlSalhi M., Devanesan S., E AlZahrani K., AlShebly M., Al-Qahtani F., Farhat K., Masilamani V. Impact of Diabetes Mellitus on Human Erythrocytes: Atomic Force Microscopy and Spectral Investigations // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2018 Oct 26;15(11):2368. doi: 10.3390/ijerph15112368.

3. Емельянов В.В., Леонтьев Д.В., Ищенко А.В., Булавинцева Т.С., Саватеева Е.А., Данилова И.Г. Атомно-силовая микроскопия эритроцитов и метаболические нарушения при экспериментальном сахарном диабете и его коррекции липоевой кислотой // Биофизика. – 2016. – Т.61, вып. 5. – С. 922 - 926.

4. Данилова И.Г., Емельянов В.В., Гетте И.Ф., Медведева С.Ю., Булавинцева Т.С., Сидорова Л.П., Черешнев В.А., Соколова К.В., Черешнева М.В. Цитокиновая регуляция регенераторных процессов в поджелудочной железе при аллоксановом сахарном диабете у крыс и его коррекции соединением ряда 1,3,4-тиадиазина и липоевой кислотой // Медицинская иммунология. - 2018. - Т. 20, № 1. - С. 35-44.

The study of the morphology of erythrocytes in diabetes mellitus (DM) in the experiment and clinic reveals a change in diameter and the appearance of abnormal cells in the bloodstream. The advantage of the atomic force microscopy (AFM) method is that it allows you to obtain information not only about the morphology of the cell, but also about the relief of the cell surface and its mechanical properties [1, 2]. The severity of morphological changes is determined by the accumulation of structural damage to the erythrocyte as a result of metabolic disorders (hyperosmolarity, activation of non-enzymatic glycation of membrane and cytoskeleton proteins, accumulation of lipid peroxidation products in the membrane) associated with hyperglycemia [1, 2, 3]. Our previous studies have shown the possibility of correcting metabolic disorders in experimental diabetes mellitus with synthetic organic compounds of a number of substituted 6H-1,3,4-thiadiazines combining antiglycative and antioxidant activity [4].When searching for new antidiabetic compounds, it is necessary to take into account not only their metabolic effects, but also the ability to correct the biophysical parameters of the erythrocyte, on which the state of microcirculation and the effectiveness of oxygenation of tissues affected by diabetes depend.

Objective: to evaluate morphological and biophysical parameters of peripheral blood erythrocytes in rats with experimental DM under conditions of its correction with substituted 6H-1,3,4-thiadiazines.

Diabetes mellitus in rats was modeled by intraperitoneal administration of alloxan at a total dose of 300 mg/kg of body weight divided into 3 fractions. The animals of the experimental groups were intramuscularly injected at a dose of 40 mg/kg with synthetic compounds L-17 and LT-27 from the class of substituted 6H-1,3,4-thiadiazines, differing in the nature of the substituent in the positions of the 2- and 5-heterocycle, diluted in water for injection. After 4 weeks, smears were prepared from the peripheral blood of animals on a substrate of freshly ground mica without the use of fixing reagents. AFM of dried preparations was carried out by a semi-contact method in an air environment on an “Integra Maximus” microscope (NT-MDT), with an NSG03 brand cantilever at an oscillation frequency of 90 kHz. The morphology of erythrocytes (diameter, height), the quantitative ratio of normal (discocytes) and abnormal (spherocytes, stomatocytes, echinocytes, etc.) cell forms, as well as the amount of cell surface adhesion were evaluated.

Erythrocytes of rats with alloxan DM were characterized, in comparison with intact animals, by large values of average diameter (9.75±0.20 and 8.8±0.32 microns, pSt <0.05) and height (448.6±19.57 and 377.5±26.33 nm, pSt<0.05), cell surface adhesion did not undergo statistically significant changes (104.5±6.73 and 90.6±19.01 nN). The introduction of compound L-17 led to a decrease in the average diameter of erythrocytes, statistically significantly lower than the values of control and intact animals (7.9±0.18 µm, pSt <0.05), the average height of cells did not change significantly (407.3±21.69 nm), and adhesion increased to 133.1±18.45 nN, pSt<0.05.

Against the background of the use of the compound LT-27, the average diameter of erythrocytes was also statistically significantly lower than the values of control and intact animals (7.2±0.27 microns, pSt<0.05), however, there was an increase in the average height of the erythrocyte to 472.4±35.27 nm, pSt<0.05, and a decrease in adhesion to 58.2±6.13, pSt<0.05, which indicates an increase in the stiffness of the membrane surface.The development of DM led to a decrease in the proportion of normal-form erythrocytes (discocytes) from 57% to 17%, px2<0.001, the predominant cell form was a spherocyte (42% vs. 20% in intact animals, px2<0.001). The introduction of compound L-17 led to an increase in poikilocytosis: discocytes were 13%, echinocytes 29%, spherocytes 23%, stomatocytes 20%, other forms 15%, px2<0.01. When correcting DM with LT-27 compound, 96% of erythrocytes were echinocytes, px2<0.001.

Thus, the study showed the ability of compounds of a number of 2,5-substituted 6H-1,3,4-thiadiazines to change the morphological and biophysical parameters of rat erythrocytes in experimental DM. The L-17 compound had the best corrective ability.

References:

1. Loyola-Leyva A., Loyola-Rodríguez J.P., Terán-Figueroa Y., Camacho-Lopez S., González F.J., Barquera S. Application of atomic force microscopy to assess erythrocytes morphology in early stages of diabetes. A pilot study // Micron. 2021 Feb;141:102982. doi: 10.1016/j.micron.2020.102982.

2. S AlSalhi M., Devanesan S., E AlZahrani K., AlShebly M., Al-Qahtani F., Farhat K., Masilamani V. Impact of Diabetes Mellitus on Human Erythrocytes: Atomic Force Microscopy and Spectral Investigations // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2018 Oct 26;15(11):2368. doi: 10.3390/ijerph15112368.

3. Emelianov V.V., Leontiev D.V., Ishchenko A.V., Bulavintseva T.S., Savateeva E.A., Danilova I.G. Atomic force microscopy of erythrocytes and metabolic disorders in experimental diabetes mellitus and its correction with lipoic acid // Biophysics. - 2016. – Vol.61, issue 5. – pp. 922-926.

4. Danilova I.G., Emelianov V.V., Gette I.F., Medvedeva S.Yu., Bulavintseva T.S., Sidorova L.P., Chereshnev V.A., Sokolova K.V., Chereshneva M.V. Cytokine regulation of regenerative processes in the pancreas iron in alloxan diabetes mellitus in rats and its correction by the combination of a number of 1,3,4-thiadiazine and lipoic acid // Medical immunology. - 2018. - Vol. 20, No. 1. - pp. 35-44.