В исследованиях механизмов протонного транспорта через мембрану особый интерес вызывают свойства протонов на поверхности мембраны. Предполагают, что их выход в водный раствор затруднен из-за потенциального барьера, образованного слоем ориентированных на поверхности молекул воды, из-за чего перенос протонов между расположенными в мембране донором и акцептором происходит внутри этого слоя. Для обоснования таких механизмов существенную роль играет оценка высоты потенциального барьера, что можно сделать, исследуя кинетику обмена протонов между мембраной и водой. Быстрый выброс протонов на границе мембраны осуществляют с помощью фотоактивируемых соединений, молекулы которых освобождают протоны при возбуждении светом. Для такие исследований необходимы методы регистрации связанных на мембране протонов, самые популярные из которых основаны на использовании флуоресцентных зондов. Однако, протоны на мембране можно регистрировать и с помощью измерения электростатического потенциала на ее границе. Ранее мы изучали изменения электрических характеристик бислойной липидной мембраны (БЛМ) при фотоактивации 2-метокси-5-нитрофенилсульфата натрия (MNPS). У его молекулы при возбуждении УФ светом отрывается связанная с ней сульфо группа и освобождается протон. Было показано, что при освещении БЛМ с адсорбированными на ней молекулами MNPS вспышкой УФ света происходит изменение ее емкости и граничного потенциала (ГП) [1]. Восстановление потенциала в темноте происходило довольно медленно, за времена порядка минуты. Для выяснения природы этих медленных процессов в настоящей работе изучались изменения ГП и емкости мембраны при фотоактивированном освобождении протонов на границе мембраны из адсорбированных на БЛМ молекул под действием постоянного света.

Изменения ГП измеряли методом компенсации внутримембранного поля [1]. При освещении БЛМ, сформированной из фосфатидилхолина, с адсорбированными на ней анионами MNPS (светодиодом, длина волны 375 нм, электрическая мощность варьировалась от 0.1 до 0.8 Вт), наблюдались обратимые изменения ГП и емкости мембраны. В изменение ГП вносят вклад как исчезновение на мембране анионов MNPS, так и связывание на ней протонов. Для определения вклада протонов разработана теоретическая модель, которая учитывает разрушение молекул MNPS на поверхности мембраны, сопряженное с освобождением протонов, а также обмен молекул MNPS и протонов между поверхностью мембраны и водным раствором. Стационарное изменение потенциала, вызванное протонами, зависело от интенсивности освещения, концентрации MNPS, буфера и рН раствора. Наиболее сильное изменение потенциала наблюдалось при высоких рН около 9, при уменьшении рН оно уменьшалось и при рН менее 6 исчезало. Зависимость от рН изменения емкости мембраны было противоположным: при уменьшении рН изменение емкости возрастало. Характерное время изменения потенциала при освещении и его восстановления в темноте составляло более 30 сек. Кинетика изменения потенциала зависела от скорости перемешивания растворов в ячейке.

Вызванные освещением изменения ГП существенно возрастали, если в БЛМ встраивали молекулы, заряд которых зависит от рН. Мы встраивали в БЛМ молекулы стириловых красителей di-4-ANEPPS или RH-421, которые адсорбируются на БЛМ в нейтральном виде и изменяют дипольный потенциал мембраны. Молекула красителя может также присоединять протон, превращаясь в заряженную форму, которая не способна адсорбироваться на БЛМ. При освещении БЛМ с адсорбированными на ней молекулами MNPS и стириловых красителей наблюдались изменения потенциала, вызванные уходом из мембраны молекул красителей, присоединивших протоны.

Полученные результаты свидетельствуют, что кинетика изменения потенциала, вызванного протонированием мембраны при фотоиндуцированном распаде молекул MNPS на поверхности БЛМ, определяется изменением концентрации протонов в неперемешиваемых слоях воды около мембраны, а величина изменения потенциала –зависимостью граничного потенциала БЛМ от рН. Заряд БЛМ из фосфатидилхолина сильнее всего изменялся в области рН от 6 до 9, где и наблюдались заметные изменения потенциала при фотоактивации MNPS. Получена оценка относительного изменения концентрации связанных на поверхности мембраны протонов при освещении мембраны с адсорбированными на ней молекулами MNPS, составлябщая примерно два порядка.

Работа выполнена при финансовой поддержке проекта РНФ № 23-24-00571.

1. В. Ю. Ташкин, В. Е Вишнякова, А. А. Щербаков, О. А. Финогенова, Ю. А. Ермаков, В. С. Соколов. Изменение емкости и граничного потенциала бислойной липидной мембраны при быстром освобождении протонов на ее поверхности. Биологические мембраны 36 (2):101-108, 2019

The investigations of the mechanisms of proton transport in membranes the attention was paid to the protons bound on the membrane surface. Their transfer to bulk water solution is assumed to delay due to a potential barrier in a layer of the oriented molecules of water, and the movement of protons between the donor and acceptor molecules in the membrane proceed inside this layer. To verify this mechanisms, the height of the barrier should be evaluated be measuring the rate of the exchange of protons between the membrane and water. To eject the protons on the membrane surface, the photoactivating compounds are used, the molecules of which release the protons on the membrane surface by exciting by light. This study requires the methods of detection of the protons bound with the membrane, the most popular among them use the membrane bound pH sensitive fluorescent probes. However, the protons bound to the membrane can be detected directly by measuring the electrostatic boundary potential (BP) on the membrane/water interface. Recently we studied the effect of the release of protons from the photoactivation of 2-methoxi-5-nitrosulfate sodium (MNPS) on the electric properties of bilayer lipid membrane (BLM). Its molecule under exciting by UV light releases the proton together with sulfo group. It was shown that the illumination of BLM with adsorbed MNPS molecules by UV light flash leads to change of the membrane capacitance and the BP [1]. The restoration of the potential in the dark was very slow and took about minute. To understand the mechanism of these slow processes, the changes of the BP and the membrane capacitance caused by the photoactivated release of protons on the membrane surface during the illumination by the continue light have been studied.

The changes of BP were measured by the method of Inner Field Compensation [1]. The illumination of BLM from phosphatidylcholine with adsorbed MNPS anions (by light emitted diode, wavelength 375 nm, electric power varied from 0.1 to 0.8 W) led to reversible changes of BP and the membrane capacitance. The changes of BP consisted of two contributions: disappearance of the MNPS anions as well of binding of the protons on the membrane. To determine the contribution due to protons binding, the theoretic model of the process has been developed taking into account the damage of the MNPS molecules on the membrane coupled with the release of protons as well as the exchange of the MNPS molecules and protons between the membrane and bulk water solution. The steady-state change of the BP caused by the protons depended on the light intensity, the concentration of MNPS, buffer and pH of the solution. The highest change of BP was observed at high pH about 9, it decreased with pH and disappeared at pH less than 6. The effect of pH on the change of the membrane capacitance was opposite: it decreased with increase of pH. The typical time of change of BP during illumination and its restoration in the dark exceeded 30 s. The kinetics of the PB change depended on the rate of stirring of the solution in the cell.

The changes of BP caused by illumination considerably increased if to incorporate into the BLM the molecules, the charge of which depends on pH. We incorporated the molecules of styryl dyes di-4-ANNEPS or RH-421, which adsorb on BLM in neutral form changing the dipole membrane potential. This molecule can also bind the proton transforming into a charged form, which does not adsorb on BLM. The illumination of BLM containing both the molecules of MNPS and styryl dyes led to change of BP due to desorption of the dyes molecules accepting the protons.

These observations indicate that the kinetics of the BP change caused by binding of protons on the membrane surface is determined by the change of the protons concentration in the unstirred layer near the membrane, and the value of the BP change - by dependence of the surface charge of BLM on pH in the solution. The highest dependence of the surface charge of BLM from phosphatidylcholine on pH was in the pH range between 6 and 9, where the highest BP changes were observed. The evaluation of relative change of the concentration of the protons released on the BLM surface under the illumination of the BLM with bound MNP molecules yields a value about two orders.

The investigation was supportied by the project of the Russian Scientific Fund № 23-24-00571

1. V. Yu. Tashkin, V. E. Vishnyakova, A. A. Shcherbakov, O. A. Finogenova, Yu. A. Ermakov, and V. S. Sokolov. Changes of the Capacitance and Boundary Potential of a Bilayer Lipid Membrane Associated with a Fast Release of Protons on Its Surface. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology 13 (2):155-160, 2019