Разобщители окислительного фосфорилирования «рассеивают» протонный градиент на внутренней мембране митохондрий, транспортируя протоны обратно в митохондрии минуя АТФ-синтетазу и приводя тем самым к разобщению окисления и фосфорилирования в митохондриях. Умеренная степень разобщения может быть полезна в терапевтических целях. На основе разобщителей могут быть созданы лекарства против ожирения и болезней, связанных с окислительным стрессом, включая нейродегенеративные заболевания. Однако многие известные в настоящее время протонофоры являются высокотоксичными веществами. Необходим поиск новых митохондриальных разобщителей, которые имеют большое окно между разобщающими и токсичными концентрациями. В связи с этим, тесты на токсичность являются ключевыми в вопросе практического применения протонофоров. В качестве тестовой системы для изучения токсичности митохондриальных разобщителей мы разработали и используем изолированную нервную систему моллюска. Преимущества этой тестовой системы: 1) Нейроны находятся в естественной среде, окружены глиальными клетками и нервными оболочками. 2) Ганглии, помещенные в солевой раствор, сохраняют функции. Например, изолированные педальные ганглии продолжают генерировать двигательный ритм, и влияние сенсорных входов незначительно. 3) В ганглиях моллюсков есть крупные нейроны, которые можно идентифицировать в различных препаратах. Это позволяет исследовать свойства индивидуальных нейронов в большом количестве разных экспериментов. 4) Нейроны моллюсков имеют весь основной набор рецепторов и ионных каналов, характерных для млекопитающих. Эксперименты проводили на нейронах изолированных ганглиев прудовика (Lymnaea stagnalis). Ганглии вырезали и раскалывали на дне ванночки, заполненной солевым раствором. Мы выделили и исследовали показатели нейронной активности, изменения которых были универсальными для всех изученных нами разобщителей. Добавление разобщителя в омывающий раствор вызывает деполяризацию нейрона, увеличение частоты спайковой активности и уменьшение амплитуды спайков. Уменьшается скорость деполяризации и реполяризации мембраны во время генерации спайка, что приводит к его расширению. Со временем клетка совсем прекращает генерировать спайки. В предлагаемой системе мы исследовали как классические митохондриальные разобщители, такие как CCCP, FCCP и DNP, так и новые разобщители, синтезированные в нашем институте. Разобщители отличаются по эффективной концентрации и по времени развития эффекта. Более слабое влияние на мембранный потенциал и спайковую активность нейрона соответствует меньшей токсичности разобщителя. Классические протонофоры CCCP и FCCP в концентрации 2 – 10 мкМ изменяли спайковую активность нейронов через 2 – 10 минут. Полное прекращение спайковой активности наблюдалось через 20 – 40 минут. В отличие от них DNP, который длительное время использовали как лекарство от ожирения, влиял на спайковую активность в концентрации 200 – 500 мкМ. Вновь синтезированный в нашем институте митохондриальный разобщитель протонофорного типа митофлуоресцеин (mitoFluo) представляет собой конъюгат флуоресцеина с децил(трифенил)фосфонием [1,2]. Качественно влияние mitoFluo подобно действию СССР, но проявляется при больших концентрациях (10 – 20 мкМ) и при гораздо более длительном воздействии (2 – 2,5 часа). Другой вновь синтезированный протонофорный разобщитель CMTPP-C10 является сложным эфиром карбоксиметилтрифенилфосфония [3]. В концентрации 10 – 20 мкМ CMTPP-C10 действует на нейроны гораздо мягче и медленнее, чем СССР. В течение часа после добавления CMTPP-C10 активность нейронов возвращается к норме. Еще одна новая группа разобщителей, производные 7-гидроксикумарина, UB-3-COOCn, проявляли протонофорные свойства, присущие другим митохондриальным разобщителям в экспериментах на липосомах и изолированных митохондриях, но при этом они почти не влияли на активность нейронов [4]. Около 10 лет назад был синтезирован протонофор ВАМ15 – производное оксадиазолопиразина. В первой статье утверждалось, что он не действует на плазматическую мембрану клеток, и поэтому не токсичен [5]. Сейчас ВАМ15 планируют использовать как лекарство в борьбе с ожирением и инсулинорезистентностью, и как геропротектор. В нашей тестовой системе мы показали, что ВАМ15 в микромолярных концентрациях (5 мкМ) вызывает такое же необратимое подавление электрической активности нейронов, как и СССР, но реакция развивается медленнее, примерно в течение часа. Следовательно, ВАМ15 токсичен даже в низких концентрациях [6]. Также мы исследовали протонофорную активность широко используемого в быту антимикробного препарата триклозана [7]. В нашей тестовой системе триклозан и СССР оказывают похожее действие на активность нейронов. Но влияние триклозана обнаруживается при более длительном воздействии (40-60 мин.) и требует больших концентраций (10-20 мкМ), что соответствует различию в разобщающей активности триклозана и СССР на митохондриях. Изменения в активности нейронов мы связываем с изменением концентрации ионов Са2+ в цитоплазме, так как протонофорные разобщители индуцируют выход кальция из митохондрий, а работа основных нейронных каналов регулируется изменениями внутриклеточной концентрации ионов кальция. Тот факт, что вновь синтезированные протонофорные разобщители оказывали слабое токсическое действие на нейроны, возможно, объясняется тем, что они подвергаются воздействию клеточных ферментов. Например, нами показано, что производные 7-гидроксикумарина UB-3-COOCn гидролизуются митохондриальной альдегиддегидрогеназой (ALDH2) [4].

Сокращения: CCCP – карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон; FCCP - карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон; DNP – 2,4-динитрофенол; UB-3-COOCn – алкиловые эфиры умбеллиферон-3-карбоновой кислоты.

Список литературы: 1. doi: 10.1039/c4cc04996a; 2. doi: 10.1134/S0006297919100043; 3. doi: 10.1016/j.abb.2022.109366; 4. doi: 10.1016/j.bioelechem.2023.108369; 5. doi: 10.1016/j.molmet.2013.11.005; 6. doi: 10.1016/j.bioelechem.2020.107673; 7. doi: 10.1016/j.bbamem.2018.01.008

Uncouplers of oxidative phosphorylation "dissipate" the proton gradient by transporting protons back to the mitochondrial matrix bypassing ATP synthetase, thereby uncoupling respiratory electron transport from ATP synthesis. Moderate uncoupling was shown to be therapeutically beneficial. Uncouplers could serve as the basis for anti-obesity drugs and medicines against pathologies associated with oxidative stress. However, many conventional protonophores are highly toxic compounds. There is an urgent need in new mitochondrial protonophoric uncouplers, which have a large window between concentration that causes uncoupling and concentration that is already toxic to cells. Toxicity tests are of key importance for practical application of new protonophores. Here, we report measurements of electrical activity of an isolated molluscan nervous system, as a test system for studying the toxicity of mitochondrial protonophore-type uncouplers. Advantages of this test system are as follows: 1) Neurons are in their natural environment, surrounded by glial cells and nerve sheaths. 2) Ganglia placed in the saline solution retain their functions. For example, isolated pedal ganglia continue to generate motor rhythm, and the effect of sensory inputs is negligible. 3) Ganglia have big neurons that can be identified from mollusk to mollusk. This allows us to explore the properties of individual neurons in a large number of various experiments. 4) Molluscan neurons have the entire basic set of receptors and ion channels, which does not qualitatively differ from those of mammals. The experiments were carried out on neurons of isolated ganglia of gastropod Lymnaea stagnalis. The ganglia were extracted and split at the bottom of a bath filled with Lymnaea saline. We have defined parameters of neuronal activity, showing universal changes with all studied uncouplers of oxidative phosphorylation. The addition of an uncoupler to the surrounding solution causes depolarization of the neuron plasma membrane, an increase in spike frequency, and a decrease in spike amplitude. The rate of spike depolarization and repolarization decreases that leads to spike broadening. Over time, the cell completely stops spike generation. In this test system, we studied both classical mitochondrial protonophoric uncouplers, such as CCCP, FCCP, and DNP, and new uncouplers synthesized at our institute. Uncouplers differ in effective concentration and in the time of the effect development. A weaker effect on the membrane potential and neuron spike activity corresponds to a lower toxicity of the uncoupler. The classical protonophores CCCP and FCCP at a concentration of 2–10μM changed the neuronal spike activity in 2–10 minutes. Complete suppression of spike activity was observed after 20-40 minutes. By contrast, DNP, which had been used for a long time as an anti-obesity drug, exhibited an effect at concentrations of 200–500µM. Recently, several new mitochondrial protonophore-type uncouplers were synthesized at our institute. The first new uncoupler tested in our system was mitofluorescein (mitoFluo), which is a conjugate of fluorescein with decyl(triphenyl)phosphonium [1,2]. Bright fluorescence of mitoFluo allowed us to track the accumulation of mitoFluo in cells. Qualitatively, the effect of mitoFluo on neurons was the same as that of CCCP, but it occurred at higher concentrations (10–20μM) and with a much longer exposure (2–2.5 hours). We obtained very interesting data with CMTPP-C10, also a newly synthesized protonophoric uncoupler [3]. At concentrations of 10 - 20µM, CMTPP-C10 affected neurons much softer and slower than CCCP. Within an hour after the addition, the neuronal activity returned to control. Another new group of uncouplers, 7-hydroxycoumarin derivatives, UB-3-COOCn, showed almost no effect on neuronal activity despite the fact that in experiments on liposomes and isolated mitochondria, they exhibited properties similar to classical uncouplers [4]. About 10 years ago, the protonophore BAM15, a derivative of oxadiazol pyrazine, was synthesized. In the first paper describing BAM15, it was declared that it is not toxic as it does not affect the plasma membrane [5]. In our test system, we have shown that BAM15 at micromolar concentrations (5μM) causes the same irreversible suppression of neuronal electrical activity as CCCP, but the reaction develops more slowly, within an hour. Therefore, BAM15 is toxic even at low concentrations [6]. We also studied the protonophoric effect of triclosan, an antimicrobial drug widely used in everyday life [7]. In our test system, triclosan and CCCP have similar effects on neuronal activity. However, the effect of triclosan is detected with a longer exposure (40–60 min.) and requires higher concentrations (10–20μM), which corresponds to the difference in the uncoupling effect of triclosan and CCCP on isolated mitochondria. We believe that the changes in neuronal activity are associated with changes in calcium ions concentration in neuron cytoplasm, since protonophoric uncouplers induce calcium release from mitochondria, and operation of the main neuronal channels is regulated by changes in the intracellular calcium ions concentration. The weak toxic effect of the newly synthesized protonophoric uncouplers on neurons might be due to interaction of these uncouplers with cellular enzymes. For example, we have shown that 7-hydroxycoumarin derivatives, UB-3-COOCn, are degraded by mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2) [4].

Abbreviations: CCCP-carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone; FCCP - p-trifluoromethoxyphenylhydrazone carbonyl cyanide; DNP - 2,4-dinitrophenol; UB-3-COOCn – alkyl esters of umbelliferone-3-carboxylic acid.

References: 1. doi: 10.1039/c4cc04996a; 2. doi: 10.1134/S0006297919100043; 3. doi: 10.1016/j.abb.2022.109366; 4. doi: 10.1016/j.bioelechem.2023.108369; 5. doi: 10.1016/j.molmet.2013.11.005; 6. doi: 10.1016/j.bioelechem.2020.107673; 7. doi: 10.1016/j.bbamem.2018.01.008