Клетки крови чувствительны к факторам внешней среды и под их воздействием могут изменять свои свойства, в том числе морфометрические параметры. Из работ, представленных в монографии [1], известно, что измененные и неизмененные эритроциты обладают неравнозначной функциональностью. Авторы связывали стойкость эритроцитов к гемолизу с их общим числом в единице объема крови и размером. Исследования, касающиеся динамики клеточных сообществ указывают на то, что функциональная неравнозначность встречается применительно между отдельным сообществам и внутри сообществ. Так клетки одного пациента вырабатывают менее активный фермент, чем клетки другого пациента, а при различных анемиях параметры отдельных эритроцитов одного пациента отклоняются от нормы в широких диапазонах, очевидно, что гипо-, гиперхромные, а также эритроциты измененной формы при пойкилоцитозе, обладают различной функциональностью.

Функциональная неравнозначность клеток крови может быть вызвана такими факторами внешнего воздействия, как наноразмерные частицы [2]. Оценка функционального статуса одной клетки относительно другой является важной исследовательской задачей.

Целью исследования является изучение влияния наноразмерных частиц диоксида кремния на морфометрические параметры мембран клеток крови (эритроциты и лейкоциты).

Исследования проводили на экспериментальном образце лазерного интерференционного микроскопа МИМ-Н (УОМЗ, Россия), укомплектованном лазером с длиной волны 650 нм. Микроскоп данной модификации предполагает работу на просвет и не требует предметных стекол с зеркальным напылением, как это обычно требуется при работе с микроскопами такого типа [3]. Лазерная интерференционная микроскопия позволяет получить «фазовый портрет» отдельных клеток крови в нативном состоянии без фиксации и окрашивания [4].

В качестве объекта исследования использовалась кровь из локтевой вены относительно здоровых добровольцев в возрасте от 30 до 36 лет. Подготовку венозной крови проводили следующим образом: забор осуществляли в вакуумную пробирку с гепарином. Затем отобранная кровь разделялась на три порции по 1 мл, первая порция рассматривалась как контрольная, вторая порция перемешивалась со стерильным физиологическим раствором в пропорциях 1:1, третья порция перемешивалась со стерильным физиологическим раствором, содержащим 15 мкл суспензии наноразмерных частиц диоксида кремния (НЧДК), также в пропорциях 1:1. Суспензия НЧДК содержала частицы размером 4-80 нм, средний размер частиц составил 16,38 нм, концентрация составила 1,21·10-6 г/мл. Вторая и третья порции крови инкубировались в термостате при температуре 37° С в течение 30 мин. Контрольная порция не инкубировалась, ранее было установлено, что инкубирование в указанных условиях нативной крови с антикоагулянтом не дает существенных отличий от выбранного контроля.

После инкубации из полученных порций крови были изготовлены препараты следующим образом: 10 мкл порции помещали на поверхность предметного стекла, затем вносили 5 мкл физиологического раствора, после на поверхность предметного стекла накладывалось покровное стекло и проводили снятие интерференционного фазового портрета. Препарат из контрольной порции был изготовлен сразу после забора. С каждой порции проводили съемку 15-20 эритроцитов и лейкоцитов.

Обработка изображений осуществлялась в программе MIM Visualiser и ImageJ-FiJi. Измеряли следующие параметры: максимальную (Hmax) и минимальную (Hmin) фазовую высоту клетки; максимальный (Dmax) и минимальный (Dmin) диаметр клетки; площадь (S) и периметр (P) контура клетки; коэффициент сферичности (KS) и фрактальную размерность контура клетки (D), а также был проведен анализ контура клетки на предмет выявления признаков мультифрактальности методом 2D. Согласно рекомендациям в статье [5], вычисляли индекс оксигенации (ИО) мембраны эритроцита, как отношение минимальной фазовой высоты к максимальной. Сравнение групповых показателей проводили по методу Манна-Уитни.

По результатам эксперимента установлено, что эритроциты и лейкоциты из группы контроля отличаются от аналогичных клеток, в группах, подвергнутых инкубированию. Клетки инкубированные с чистым физиологическим раствором и раствором с добавлением наноразмерных частиц диоксида кремния также отличаются между собой.

Действие НЧДК на морфометрические параметры эритроцитов выражено в том, что изменяется их индекс оксигенации, а также фрактальные свойства контура.



Библиографический список



1. Клиорин А.И., Тиунов Л.А. Функциональная неравнозначность эритроцитов: Л.: Наука. – 1974, 148 с.

2. Землянова М.А., Зайцева Н.В., Игнатова А.М., Степанков М.С., Торопов Л.И., Кольдибекова Ю.В. Исследование и оценка гематологических показателей крови и морфометрических параметров эритроцитов крыс при воздействии наночастиц оксида кальция//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2020, Т. 170. № 11. – с. 631-635.

3. Баяндин Ю.В., Никитюк А.С., Воронина А.О., Белоглазова Ю.А., Гагарских О.Н., Гришко В.В., Наймарк О.Б. Анализ морфометрических и фрактальных свойств фазово-контрастных изображений нативных и апоптотически измененных клеток mcf-7 // Российский журнал биомеханики. - 2020. - Т.24, №3. - С.312-322.

4. Игнатова, А.М. Анализ рельефа опухолевых клеток MCF-7 при апоптических изменениях на основе фазово-контрастных изображений, полученных методом лазерной интерференционной микроскопии. / А.М. Игнатова, А.С. Никитюк, Ю.В. Баяндин, В.В. Гришко, О.Б. Наймарк // Вычислительная механика сплошных сред. –2021. –Т. 14, No 2. –С. 171-176.

5. Золотовская И.А., Давыдкин И.Л., Дупляков Д.В., Лимарева Л.В., Сустретов А.С. Влияние антикоагулянтной терапии на оксигенацию мембран эритроцитов во взаимосвязи с показателями микроциркуляции у пациентов с фибрилляцией предсердий// Кардиология: Новости. Мнения. Обучение. – 2018, №1(16). – с. 82-90. doi:10.24411/2309-1908-2018-00004



Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Государственный контракт № АААА-А19-119013090021-5)

Blood cells are sensitive to environmental factors and under their influence can change their properties, including morphometric parameters. From the works presented in the monograph [1], it is known that altered and unchanged erythrocytes have unequal functionality. The authors associated the resistance of erythrocytes to hemolysis with their total number per unit of blood volume and size. Studies concerning the dynamics of cellular communities indicate that functional disparity occurs in relation to individual communities and within communities. Thus, the cells of one patient produce a less active enzyme than the cells of another patient, and with various anemia, the parameters of individual erythrocytes of one patient deviate from the norm in wide ranges, it is obvious that hypo-, hyperchromic, as well as altered erythrocytes with poikilocytosis, have different functionality.

Functional disparity of blood cells can be caused by external factors such as nanoscale particles [2]. Evaluation of the functional status of one cell relative to another is an important research task.

The aim of the study is to study the effect of nanoscale silicon dioxide particles on the morphometric parameters of blood cell membranes.

The research was carried out on an experimental sample of a laser interference microscope MIM-N (Russia) equipped with a laser with a wavelength of 650 nm. The microscope of this modification assumes work on the lumen and does not require slides with a mirror coating, as is usually required when working with microscopes of this type [3]. Laser interference microscopy makes it possible to obtain a "phase portrait" of individual blood cells in the native state without fixation and staining [4].

Blood from the ulnar vein of relatively healthy volunteers aged 30 to 36 years was used as the object of the study. Venous blood preparation was carried out as follows: sampling was carried out in a vacuum tube with heparin. Then the selected blood was divided into three portions of 1 ml, the first portion was considered as a control, the second portion was mixed with a sterile saline solution in proportions of 1:1, the third portion was mixed with a sterile saline solution containing 15 µl of a suspension of nanoscale particles of silicon dioxide (NCHDC), also in proportions of 1:1. The NCHDC suspension contained particles of 4-80 nm in size, the average particle size was 16.38 nm, the concentration was 1.21·10-6 g/ml. The second and third portions of blood were incubated in a thermostat at 37 ° C for 30 minutes. The control portion was not incubated, it was previously found that incubation of native blood with an anticoagulant under these conditions does not significantly differ from the selected control.

After incubation, preparations were made from the obtained portions of blood as follows: 10 ml of the portion was placed on the surface of the slide, then 5 ml of saline solution was introduced, after which a cover glass was applied to the surface of the slide and the interference phase portrait was removed. The drug from the control portion was made immediately after sampling. 15-20 erythrocytes and leukocytes were taken from each portion.

Image processing was carried out in the program MIM Visualiser and ImageJ-FiJi. The following parameters were measured: maximum (Hmax) and minimum (Hmin) phase height of the cell; maximum (Dmax) and minimum (Dmin) diameter of the cell; area (S) and perimeter (P) of the cell contour; sphericity coefficient (KS) and fractal dimension of the cell contour (D), and the analysis was carried out the contour of the cell for the detection of signs of multifractality by the 2D method. According to the recommendations in the article [5], the oxygenation index (IO) of the erythrocyte membrane was calculated as the ratio of the minimum phase height to the maximum. The comparison of group indicators was carried out using the Mann-Whitney method.

According to the results of the experiment, it was found that erythrocytes and leukocytes from the control group differ from similar cells in groups subjected to incubation. Cells incubated with a pure saline solution and a solution with the addition of nanoscale particles of silicon dioxide also differ from each other.

The effect of NCDC on the morphometric parameters of erythrocytes is expressed in the fact that their oxygenation index changes, as well as the fractal properties of the contour.



Bibliographic list



1. Kliorin A.I., Tiunov L.A. Functional inequality of erythrocytes: L.: Nauka. – 1974, 148 p.

2. Zemlyanova M.A., Zaitseva N.V., Ignatova A.M., Stepankov M.S., Toropov L.I., Koldibekova Yu.V. Investigation and evaluation of hematological parameters of blood and morphometric parameters of rat erythrocytes under the influence of calcium oxide nanoparticles//Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2020, vol. 170. No. 11. – pp. 631-635.

3. Bayandin Yu.V., Nikityuk A.S., Voronina A.O., Beloglazova Yu.A., Gagarskikh O.N., Grishko V.V., Naimark O.B. Analysis of morphometric and fractal properties of phase-contrast images of native and apoptotically altered mcf-7 cells // Russian Journal of Biomechanics. - 2020. - Vol.24, No. 3. - pp.312-322.

4. Ignatova, A.M. Analysis of the relief of MCF-7 tumor cells with apoptic changes based on phase-contrast images obtained by laser interference microscopy. / A.M. Ignatova, A.S. Nikityuk, Yu.V. Bayandin, V.V. Grishko, O.B. Naimark // Computational mechanics of continuous media. -2021. –T. 14, No. 2. –pp. 171-176.

5. Zolotovskaya I.A., Davydkin I.L., Duplyakov D.V., Limareva L.V., Sustretov A.S. Effect of anticoagulant therapy on oxygenation of erythrocyte membranes in relation to microcirculation parameters in patients with atrial fibrillation// Cardiology: News. Opinions. Training. – 2018, №1(16). – pp. 82-90. doi:10.24411/2309-1908-2018-00004



The work was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (No. AAAA19-119013090021-5)