Кальций, как известно, является медиатором многих процессов, происходящих в организме. При действии гормонов, электрических импульсов или других факторов Са2+ поступает в цитоплазму и активирует определённые функции, после чего внутриклеточная концентрация этого иона должна снижаться до контрольного уровня. Этот процесс в клетке контролируется преимущественно митохондриями, в которых есть системы, связывающие Ca2+ с высоким сродством. Однако, при интенсивном функционировании клетки, а также при патологиях, особенно сопровождающихся продолжительной гипоксией, когда Ca2+ накапливается в цитоплазме в повышенных количествах, может произойти перегрузка митохондрий этим ионом. В результате, возникает опасность появления во внутренней мембране митохондрий неспецифической проницаемости в результате образования митохондриальной поры (МРТ поры), приводящей к апоптозу или некрозу клеток. Механизм этой проницаемости связан с открытием мегаканала, чувствительного к циклоспорину A (ЦсА), который имеет белковую природу. В работе мы показали, что помимо пути, связанного с открытием белковой поры, в митохондриях может происходить открытие короткоживущих липидных пор, появляющихся в мембране с матриксной стороны при накоплении комплексов пальмитиновой кислоты с ионами Ca2+. Эти поры не регулируются ЦсА и, по всей видимости, играют защитную роль, предупреждая митохондрии от накопления в них больших концентраций иона и открытия МРТ поры.

Ранее нами было показано, что насыщенные длинноцепочечные свободные жирные кислоты связывают Са2+ с высоким сродством, которое на 1.5-2 порядка выше, чем сродство к этому иону других жирных кислот и липидов. Эти кислоты в присутствии Са2+ способны индуцировать ионную проницаемость бислойной липидной мембраны, и неспецифическую проницаемость как липосомальной мембраны, так и внутренней мембраны митохондрий, выделенных из разных тканей. Эти исследования позволили предположить общий универсальный механизм образования пальмитат/Са2+-индуцированной проницаемости в бислойных липидных мембранах, отличный от механизма образования MPT поры.

На основании проведенных экспериментов на липосомах с применением флуоресцентных зондов было предположено, что механизм образования этой поры в липидном бислое связан с хемотропным фазовым переходом.

Известно, что вход Са2 + в митохондрии приводит к активации фосфолипазы А2 и появлению свободных жирных кислот, в основном пальмитиновой и стеариновой. При их накоплении в матриксе митохондрий возможно образование, по нашим данным, комплексов этих кислот с Ca2 + и открытие короткоживущих пор по описанному выше механизму. Так как эти поры имеют малый диаметр, они быстро закрываются и, как мы показали, не влияют на работу дыхательной цепи, восстанавливая при этом ионный гомеостаз. В присутствии Са2+(Sr2+)-зависимых ингибиторов фосфолипазы А2, накопление свободных жирных кислот не наблюдается. При этом блокируются вызванные Sr2+ в присутствии валиномицина спонтанные циклические изменения в концентрации К+, Са2+, Н+, мембранного потенциала, набухания, скорости потребления кислорода и скорости образования H2O2 в митохондриях. Подавление вышеописанных осцилляций ингибиторами фосфолипазы А2 мы связываем с отсутствием в матриксе свободных жирных кислот и невозможностью в этих условиях открытия липидной поры. В результате блокируется как выход ионов К+ и Са2+ из митохондрий, так и вход в них Н+ по концентрационному градиенту, тогда как индукция образования поры уравновешивает ионные градиенты через митохондриальную мембрану. Следовательно, открытие липидной поры обеспечивает К+/Н+ и Са2+/Н+ обмен в митохондриях. Участие Са2+-зависимой фосфолипазы А2 в этом процессе подтверждается тем, что ингибитор Са2+-независимой фосфолипазы А2 не влиял на описанные выше осцилляции. Этот путь, вероятно, играет защитную роль против токсичности Ca2+ и АФК.

Открытие липидной поры, по полученным нами данным, снижает вероятность появления в митохондриях белковой поры, которая, как известно, ответственна за гибель клетки. Одной из особенностей липидной поры является её способность индуцироваться относительно небольшими количествами Са2+ т.е., эти поры появляются в митохондриальной мембране до того, как органеллы будут перегружены Ca2+ до степени, запускающей открытие МРТ поры. Это предположение было подтверждено сравнительными исследованиями параметров образования липидной поры и МРТ поры в митохондриях разных тканей крыс с генетически измененной устойчивостью к гипоксии. Эксперименты показали, что митохондрии устойчивых к гипоксии животных более восприимчивы к открытию липидной поры и более устойчивы к открытию МРТ поры, по сравнению с органеллами чувствительных к гипоксии крыс. Результаты, полученные в этих экспериментах, нашли дальнейшее подтверждение при исследованиях на двух линиях крыс (Август и Вистар) с разным уровнем окислительного фосфорилирования (ОКСФОС). При этом крысы линии Август имели более высокую скорость дыхания и эффективность ОКСФОС, а также более высокие скорости транспорта калия и набухания митохондрий и более низкие скорости продукции H2O2. Они же были менее чувствительны к гипоксии и стрессу. При этом, липидные поры легче формировались в митохондриях резистентных к гипоксии крыс. Таким образом, полученные нами результаты подтверждают предположение о том, что чем эффективнее работает липидная пора, тем труднее открывается белковая пора. Важно подчеркнуть, что образование липидных пор не разобщает ОКСФОС в митохондриях, позволяя органеллам поддерживать снабжение клеток энергией во время стресса. Следовательно, липидная пора может обеспечивать защиту от перегрузки митохондрий ионами Ca2+. Это предположение также может объяснить эффекты ингибиторов фосфолипазы А2 на открытие МРТ поры, задокументированное группой Pfeiffer в 2006 г.

Работа поддержана грантом РНФ №23-25-00441.

Calcium is known to be a mediator of many processes occurring in the body. Under the action of hormones, electrical impulses or other factors, Ca2+ enters the cytoplasm and activates certain functions, after which the intracellular concentration of this ion should decrease to a control level. This process in the cell is controlled mainly by mitochondria, which have systems that bind Ca2+ with high affinity. However, with intensive cell functioning, as well as with pathologies, especially accompanied by prolonged hypoxia, when Ca2+ accumulates in the cytoplasm in increased amounts, mitochondria may overload with this ion. As a result, there is a danger of the appearance of nonspecific permeability in the inner membrane of mitochondria as a result of the formation of a mitochondrial permeability transition pore (MPT pore), leading to apoptosis or necrosis of cells. The mechanism of this permeability is associated with the discovery of a mega-channel sensitive to cyclosporine A (CsA), which has a protein nature. In our work, we have shown that in addition to the pathway associated with the opening of the protein pore, short-lived lipid pores can be opened in mitochondria, appearing in the membrane from the matrix side during the accumulation of palmitic acid complexes with Ca2+ ions. These pores are not regulated by CsA and, apparently, play a protective role, preventing mitochondria from accumulating large concentrations of the ion and the MPT pore opening.

We have previously shown that saturated long-chain free fatty acids bind Ca2+ with a high affinity, which is 1.5-2 orders of magnitude higher than the affinity for this ion of other fatty acids and lipids. These acids in the presence of Ca2+ are able to induce the ionic permeability of the bilayer lipid membrane, and the nonspecific permeability of both the liposomal membrane and the inner membrane of mitochondria isolated from different tissues. These studies have suggested a common universal mechanism of palmitate/Ca2+-induced permeabilization of bilayer lipid membranes, different from the mechanism of MPT pore formation.

Based on the experiments conducted on liposomes, it was assumed that the mechanism of formation of this pore in the lipid bilayer is associated with a chemotropic phase transition.

It is known that the entry of Ca2+ into mitochondria leads to the activation of phospholipase A2 and the appearance of free fatty acids, mainly palmitic and stearic. When they accumulate in the mitochondrial matrix, it is possible, according to our data, to form complexes of these acids with Ca2+ and to open short-lived pores according to the mechanism described above. Since these pores have a small diameter, they close quickly and, as we have shown, do not affect the work of the respiratory chain, while restoring ionic homeostasis. In the presence of Ca2+ (Sr2+)-dependent phospholipase A2 inhibitors, the accumulation of free fatty acids is not observed. At the same time, spontaneous cyclic changes in the concentration of K+, Ca2+, H+, membrane potential, swelling, oxygen consumption rate and the rate of H2O2 formation in mitochondria caused by Sr2+ in the presence of valinomycin are blocked. The suppression of the above-described oscillations by phospholipase A2 inhibitors is associated with the absence of free fatty acids in the matrix and the impossibility of opening a lipid pore under these conditions. As a result, both the output of K+ and Ca2+ ions from mitochondria and the entry of H+ into them along the concentration gradient are blocked, while the induction of pore formation balances the ionic gradients through the mitochondrial membrane. Consequently, the opening of the lipid pore provides K/H and Ca/H exchange in mitochondria. The participation of Ca2+-dependent phospholipase A2 in this process is confirmed by the fact that the inhibitor of Ca2+-independent phospholipase A2 did not affect the oscillations described above. This pathway probably plays a protective role against the toxicity of Ca2+ and ROS.

The opening of the lipid pore reduces the likelihood of the appearance of a protein pore in the mitochondria, which is known to be responsible for cell death. One of the features of the lipid pore is its ability to be induced by relatively small amounts of Ca2+, i.e., these pores appear in the mitochondrial membrane before the organelles are overloaded with Ca2+ to the extent that triggers the opening of MPT pore. This assumption was confirmed by comparative studies of the parameters of formation of lipid and MPT pores in the mitochondria of different tissues of rats with genetically modified resistance to hypoxia. Experiments have shown that the mitochondria of hypoxia-resistant animals are more susceptible to the opening of the lipid pore and more resistant to the opening of MPT pore, compared with the organelles of hypoxia-sensitive rats. The results obtained were further confirmed by studies on two rat lines (August and Wistar) with different levels of oxidative phosphorylation (OXYPHOS). At the same time, August rats had a higher respiration rate and OXYPHOS efficiency, as well as higher rates of potassium transport and mitochondrial swelling and lower rates of H2O2 production. They were also less sensitive to hypoxia and stress. At the same time, lipid pores formed more easily in the mitochondria of hypoxia-resistant rats. Thus, our results confirm the assumption that the more efficiently the lipid pore works, the more difficult it is to open the protein pore. The formation of lipid pores does not inhibit OXYPHOS in mitochondria, allowing organelles to maintain the supply of energy to cells during stress. Consequently, the lipid pore can provide protection against mitochondrial overload with Ca2+ ions. This assumption may also explain the effects of phospholipase A2 inhibitors on the opening of the MPT pore, documented by the Pfeiffer group in 2006.

The work was supported by the RSF grant No. 23-25-00441.