Известно, что ожирение является предшественником различных патологий (сахарного диабета 2 типа, рака, артрита, гипертонии и др.) и характеризуется вялотекущим хроническим воспалением. Воспалительный каскад при ожирении инициируют, главным образом, полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы), наиболее реактивные клетки врожденного иммунитета с высоким цитотоксическим потенциалом, включающим продукцию активных форм кислорода. Показано изменение функциональной активности нейтрофилов при ожирении, однако в условиях устойчивости к ожирению функционирование нейтрофилов, включающее генерацию активных форм кислорода, не исследовано.

Цель работы - исследовать НАДФН-оксидазо-зависимую генерацию реактивных форм, опосредованную высоко- и низкоафинными рецепторами формилированных пептидов (Fpr1, Fpr2) в гранулоцитах костного мозга у устойчивых к ожирению мышей (УОM). Поскольку длительное потребление высокожировой диеты (ВЖД) является стрессорным фактором, изменяющим иммунный профиль у склонных к ожирению мышей, мы предположили, что у мышей, устойчивых к ожирению, будет также наблюдаться модификация функций иммунных клеток, включая продукцию реактивных форм, инициированную мембранными рецепторами формилированных пептидов.

В исследовании использованы самцы мышей линии C57BL/6j, содержащиеся в барьерных условиях на ВЖД (общей калорийностью 516 ккал/100 г) в течение 16 недель. Контролем служила группа животных, содержащихся в условиях стандартной диеты (калорийность 306 ккал/100 г). Включенные в эксперимент мыши, получавшие ВЖД, не отличались от контрольных мышей по длине и массе тела. Мышей, получавших ВЖД и имеющих значительно более высокий прирост массы тела, чем контрольная группа, в экспериментальную группу не включали. Были сформированы четыре экспериментальных группы: (I) – контроль; (II) контроль с острым воспалением; (III) УОМ; (IV) УОМ с острым воспалением. Острое воспаление вызывали внутрибрюшинным введением суспензии зимозана в растворе Хэнкса (5 мг/мл, 150 мкл) за 12 ч до эксперимента. Контрольной группе (I) и УОМ (III) вводили 150 мкл раствора Хэнкса внутрибрюшинно.

Проводили биохимический анализ, определяли концентрацию глюкозы в цельной крови, измеряли относительную массу органов кроветворения с активно пролиферирующей тканью (тимус, селезенка, печень). Гранулоциты изолировали из костного мозга методом центрифугирования в градиенте плотности перколла. Метод хемилюминесцентного анализа применяли для оценки интенсивности генерации реактивных форм, которую инициировали 1 мкМ N-formyl-MLF (fMLF, активация Fpr1) и 1 мкМ WKYMVM (синтетический агонист Fpr2). Ингибиторы PLC (U73122, 0.2 and 2 мкM), PKC (GF109203X, 1 мкM), p38MAPK (SB202190, 10 мкM), ERK1/2 (FR180204, 10 мкM), JNK (SP600125, 10 мкM), применяли для выявления участия данных ферментов в сигнальной трансдукции от Fpr1 и Fpr2 на НАДФН-оксидазу у УОМ. Рассчитывали амплитуду ответа и продукцию реактивных форм. Эффект ингибиторов определяли, как отношение параметра, полученного от клеток, обработанных ингибитором, к параметру интактных клеток, принятому за 100%.

Показан более высокий уровень спонтанной продукции реактивных видов в клетках УОМ. Средняя эффективная концентрация (EC50) для ответов на N-formyl-MLF была выше у УОМ с воспалением и без него по сравнению с соответствующими контрольными группами, что указывает на незначительную роль Fpr1. Повышенные ответы на WKYMVM (агонист Fpr2) были в контроле с острым воспалением, но они были сходными в других группах. Возможно, Fpr2 были частично инактивированы у УОМ из-за наличия воспалительного процесса. ВЖД и острое воспаление привело к усилению положительной регуляции активности NADPH-оксидазы с помощью PLC. Результаты показали снижение роли PKC в регуляции активности НАДФН-оксидазы через рецепторы формилированных пептидов в гранулоцитах УОМ, а также в клетках контроля с воспалением, активированным через Fpr2. Было выявлено ослабление передачи сигналов Fpr1 и Fpr2 через митоген-активируемые протеинкиназы (МАРКs) в гранулоцитах УОМ при использовании специфических ингибиторов p38, ERK1/2, JNK. Передача сигналов p38 через Fpr2 была ниже у УОМ при воспалении. Таким образом, диета с высоким содержанием жиров модифицировала роль Fpr1 и Fpr2, а также подавляла передачу сигналов MAPKs в регуляции NADPH-оксидазы у УОМ. Полученные данные могут быть полезны для понимания иммунологических особенностей устойчивости к ожирению и открытия возможности использования рецепторов формилированных пептидов в качестве потенциальных терапевтических мишеней для подавления воспаления, связанного с ожирением, и разработки стратегий борьбы с метаболическими нарушениями, обусловленными ожирением.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (№22-15-00215).

It is known that obesity is a precursor of various pathologies (type 2 diabetes mellitus, cancer, arthritis, hypertension, etc.) and is characterized by low grade chronic inflammation. The inflammatory cascade in obesity is initiated mainly by polymorphonuclear neutrophilic granulocytes (neutrophils), the most reactive cells of innate immunity with a high cytotoxic potential, including the production of reactive oxygen species. A change in the functional activity of neutrophils in obesity was shown, however, neutrophil functioning s, including the generation of reactive oxygen species, has not been studied under conditions of resistance to obesity.

The aim of the work was to investigate NADPH-oxidase-dependent generation of reactive species initiated thought membrane formyl peptide receptors (Fpr1, Fpr2) in bone-marrow granulocytes of obesity-resistant mice (ORM). As long-term high fat diet (HDF) consuming is a stressor factor modifying immune profile in obesity-prone mice, we assumed that in obesity-resistant mice it would also modify immune cell functions including production of reactive species initiated by membrane formyl peptide receptors.

Male C57BL/6j mice were used in the study and kept under barrier conditions on HFD (total calorie content of 516 kcal/100 g) for 16 weeks. A group of animals kept on a standard diet (calorie content 306 kcal/100 g) served as a control. The mice included in the experiment, which received HFD and did not differ from controls in body length and weight. The mice fed HFD and having significantly higher body weight gain than controls were not taken in the experimental group.

Then four groups were formed: (I) controls; (II) controls with acute inflammation; (III) ORM; (IV) ORM with acute inflammation. An acute inflammation was caused by intraperitoneal injection of zymosan suspension in Hanks’ solution (5 mg/ml, 150 µl) 12 hours before the experiment. Controls (I) and ORM (III) were injected by 150 µl Hanks’ solution intraperitoneally.

A biochemical analysis was carried out, the concentration of glucose level in the whole blood of animals was determined and the relative mass of hematopoietic organs with actively proliferating tissue (thymus, spleen, liver) was measured. Granulocytes were isolated from the bone marrow by centrifugation in a percoll density gradient. Chemiluminescent analysis was used to assess the intensity of reactive species generation, which was initiated by 1 μM N-formyl-MLF (fMLF, activation of Fpr1) and 1 μM WKYMVM (synthetic agonist Fpr2). Inhibitors of PLC (U73122, 0.2 and 2 µM), PKC (GF109203X, 1 µM), p38MAPK (SB202190, 10 µM), ERK1/2 (FR180204, 10 µM), JNK (SP600125, 10 µM), were used to establish the role of indicated enzymes in the signal transduction from FPRs to NADPH oxidase in ORM. Response amplitude and production of reactive species were estimated. The effect of the inhibitors was calculated as the ratio of the parameter obtained from the cells treated with the inhibitor to the parameter of the intact cells taken as 100%.

A higher level of spontaneous RS production in ORM cells was shown. Half maximal effective concentration (EC50) for N-formyl-MLF responses was higher in ORMs with and without inflammation compared to the same controls, indicating a insignificant role of Fpr1. Increased responses to WKYMVM (Fpr2 agonist) was in controls with acute inflammation, but they were similar in other groups. Possibly Fpr2 were partially inactivated in ORM owing their inflammatory state. HFD and acute inflammation led to increase of the positive regulation of NADPH-oxidase activity by PLC. Our results demonstrated decreased role of PKC in regulation of NADPH-oxidase activity initiated by formyl peptide receptors in ORM granulocytes, and also in the cells of controls with inflammation activated via Fpr2.

Weakened Fpr1 and Fpr2 signaling via MAPKs was revealed in ORM granulocytes using specific inhibitors for p38, ERK1/2, JNK. P38 signaling via Fpr2 was lower in ORM with inflammation. Thus, HFD modified the role of formyl peptide receptors and suppressed MAPKs signaling in NADPH-oxidase regulation in ORM.

The data obtained may be useful to understand immunological features of obesity resistance and open the possibility of using of formyl peptide receptors as potential therapeutic targets to inhibit obesity-related inflammation and develop strategies against obesity-related metabolic disorders.

The study was financially supported by the Russian Science Foundation (№22-15-00215).