Недавно нами было показано, что предшественники стабилизированных фосфониевых илидов такие, как (децилоксикарбонилметил)трифенилфосфоний бромид (CMTPP-C10) и его аналоги с разной длиной алкила, переносят ионы водорода через искусственные липидные мембраны, а также мембраны митохондрий и хлоропластов [1]. Протонный транспорт осуществляется в результате циклического движения катионной и нейтральной (фосфорного илида) форм фосфониевого производного в липидных мембранах.

Известно, что константа скорости флип-флопа через липидные мембраны алкилтрифенилфосфония, являющегося катионом, значительно увеличивается при введении метильных групп в фенильные кольца [2]. Механизм действия протонофоров, являющихся слабыми кислотами, предполагает, что протонный транспорт линейно растет с увеличением их коэффициента адсорбции [3]. Мы предположили, что введение метильных групп в фенильные кольца трифенилфосфония увеличит скорость проникновения катионной формы соединений, а уменьшение длины алкила на такое же количество метиленовых групп позволит сохранить липофильность соединений и коэффициент их адсорбции на поверхности мембраны. Нами были синтезированы и изучены на плоских бислойных липидных мембранах предшественники стабилизированных илидов трифенилфосфония с одной или двумя метильными группами в фенильных кольцах: (гептилоксикарбонилметил)три(п-толил)фосфоний бромид (CMTTP-C7) и (бутилоксикарбонилметил)три(3,5-диметилфенил)фосфоний бромид (CMTPP-diMe-C4).

При низком рН (рН=2.2) добавление фосфониевых солей к плоской бислойной липидной мембране (БЛМ), сформированной из дифитанилфосфатидилхолина, приводило к появлению релаксации тока через мембрану после скачкообразного прикладывания напряжения. Кинетика релаксации ускорялась с увеличением напряжения. Значения характерного времени релаксации при снятии напряжения были равны 2.30.1 c, 8.21.0 c и 31.49.0 c для CMTPP-diMe-C4, CMTTP-C7 и CMTPP-C10, соответственно. При увеличении рН водного раствора кинетики релаксации тока ускорялись, стационарный ток через БЛМ увеличивался для всех соединений. Зависимость стационарного тока от рН имела колоколообразную форму с максимумом при рН=5.0 для CMTPP-C10, рН=7.0 для CMTTP-C7 и рН=8.0 для CMTPP-diMe-C4. Значения стационарного тока БЛМ при рН=8.0 значительно увеличивались с ростом числа метильных групп в фенильных кольцах. Для всех соединений ток через мембрану был обусловлен транспортом протонов, так как сдвиг вольт-амперной характеристики БЛМ при создании градиента концентрации протонов был близок к теоретическим значениям.

При формировании БЛМ из липида со сложноэфирными связями (дифитаноилфосфатидилхолина) стационарная проводимость мембраны, вызванная добавлением производных карбоксиметилтриарилфосфония, уменьшалась в десятки раз по сравнению с БЛМ из липида с простыми эфирными связями. Это объясняется замедлением транслокации через БЛМ липофильных катионов вследствие увеличения скачка дипольного потенциала мембраны. Последующее добавление липофильного аниона тетрафенилбората к БЛМ из дифитаноилфосфатидилхолина в концентрациях на два порядка ниже концентрации фосфониевых катионов приводило к значительному возрастанию стационарного протонного тока.

Наши данные подтверждают предположение о том, что стадия транслокации катионной формы соединений является лимитирующей в транспорте протонов через бислойные липидные мембраны. Увеличение константы скорости транслокации заряженной формы протонофоров приводит к увеличению потока протонов через мембраны.





[1] Kirsanov, R.S. et al. Ester-stabilized phosphorus ylides as protonophores on bilayer lipid membranes, mitochondria and chloroplasts. Bioelectrochemistry 2023, 150, 108369.

[2] Rokitskaya, T.I. et al. Effect of Methyl and Halogen Substituents on the Transmembrane Movement of Lipophilic Ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 2019, 21, 23355-23363.

[3] McLaughlin, S. The Mechanism of Action of DNP on Phospholipid Bilayer Membranes. J. Membr. Biol. 1972, 9, 361-372.

We have recently shown that precursors of stabilized phosphonium ylides, such as (decyloxycarbonylmethyl)triphenylphosphonium bromide (CMTPP-C10) and its analogs with different alkyl lengths, carry hydrogen ions through artificial lipid membranes, as well as membranes of mitochondria and chloroplasts [1]. The proton transport results from the cyclic movement of the cationic and neutral (phosphorus ylide) forms of the phosphonium derivative in lipid membranes.

It is known that the rate constant of flip-flop of an alkyltriphenylphosphonium cation through lipid membranes increases significantly upon the introduction of methyl groups into the phenyl rings [2]. The mechanism of action of protonophores, being weak acids, suggests that proton transport increases linearly with an increase in their adsorption coefficient [3]. We assumed that the introduction of methyl groups into the phenyl rings of triphenylphosphonium would increase the rate of membrane permeation of the cationic form of the compounds, while reducing the length of the alkyl by the same number of methylene groups would preserve the lipophilicity of the compounds and the coefficient of their adsorption on the membrane surface. We synthesized the precursors of stabilized triphenylphosphonium ylides with one or two methyl groups in the phenyl rings: (heptyloxycarbonylmethyl)tri(p-tolyl)phosphonium bromide (CMTTP-C7) and (butyloxycarbonylmethyl)tri(3,5- dimethylphenyl)phosphonium bromide (CMTPP-diMe-C4), and studied them on planar bilayer lipid membranes.

At low pH (pH=2.2), the addition of the phosphonium salts to the planar bilayer lipid membrane (BLM) formed from diphytanylphosphatidylcholine led to the appearance of relaxation of the current through the membrane after application of a voltage jump. The relaxation kinetics accelerated with increasing voltage. The values of the characteristic relaxation time upon the voltage switching off were 2.31.0 s, 8.29.0 s and 31.40.1 s, for CMTPP-diMe-C4, CMTTP-C7, and CMTPP-C10, respectively. As the pH of the aqueous solution increased, the current relaxation kinetics accelerated, and the stationary current through the BLM increased for all compounds. The dependence of the stationary current on pH was bell-shaped with a maximum at pH=5.0 for CMTPP-C10, pH=7.0 for CMTTP-C7, and pH=8.0 for CMTPP-diMe-C4. The values of the stationary BLM current at pH=8.0 increased significantly with an increase in the number of methyl groups in the phenyl rings. For all compounds, the current through the membrane was due to the transport of protons, since the shift in the current-voltage characteristics of the BLM observed upon the creation of the proton concentration gradient was close to the theoretical value.

In the case of BLM formed from the lipid with ester bonds (diphytanoylphosphatidylcholine), the steady-state conductance caused by the addition of carboxymethyltriarylphosphonium derivatives decreased tenfold compared to BLM from the lipid with ether bonds. This is explained by the retardation in the translocation of lipophilic cations through the BLM due to an increase in the membrane dipole potential. The subsequent addition of the lipophilic tetraphenylborate anion to BLM from diphytanoylphosphatidylcholine at concentrations two orders of magnitude lower than the concentration of phosphonium cations led to a significant increase in the stationary proton current.

Our data confirm the assumption that the translocation of the cationic form of compounds is the limiting stage in the transport of protons through bilayer lipid membranes. An increase in the translocation rate constant of the charged form of protonophores leads to an increase in the proton flux through the membranes.



[1] Kirsanov, R.S. et al. Ester-stabilized phosphorus ylides as protonophores on bilayer lipid membranes, mitochondria and chloroplasts. Bioelectrochemistry 2023, 150, 108369.

[2] Rokitskaya, T.I. et al. Effect of Methyl and Halogen Substituents on the Transmembrane Movement of Lipophilic Ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 2019, 21, 23355-23363.

[3] McLaughlin, S. The Mechanism of Action of DNP on Phospholipid Bilayer Membranes. J. Membr. Biol. 1972, 9, 361-372.