Сахарный диабет – метаболическое заболевание, связанное либо с нарушением секреции инсулина  клетками поджелудочной железы (сахарный диабет I типа), либо с инсулинорезистентностью органов и тканей организма человека и животных (сахарный диабет II типа). Вследствие этого происходит развитие гипергликемии, которая сопровождается нарушением белкового и липидного обмена. Эти нарушения приводят к патологическим изменениям в органах и тканях организма [1].

Общепризнано, что митохондриальная дисфункция является одним процессов, вовлеченных в развитие сахарного диабета на клеточном уровне. Действительно, для многих органов и тканей, а также клеточных линий продемонстрировано, что сахарный диабет или гипергликемия приводят к усиленной генерации активных форм кислорода митохондриями, нарушению процессов окислительного фосфорилирования и падению мембранного потенциала. Считается, что это связано с нарушением клеточного контроля качества митохондрий – внутриклеточной системы, ответственной за митофагию, митохондриальный биогенез и митохондриальную динамику [2].

Митохондриальный метаболизм требует эффективного обмена ионами и метаболитами между митохондриями и цитоплазмой через внешнюю митохондриальную мембрану. Этот обмен осуществляется с помощью белков – поринов (или потенциал-зависимых анионных каналов – VDAC). В связи с этим не удивительно, что VDAC может быть вовлечен в широкий спектр патологий связанных с митохондриями [3]. Так недавние исследования показали, что при развитии сахарного диабета наблюдается избыточная экспрессия белка VDAC1 [2,4]. Это предполагает его возможную роль в патогенезе данного заболевания. В связи с этим целью настоящей работы было исследовать влияние фармакологического и генетического ингибирования VDAC на развитие митохондриальной дисфункции в условиях гипергликемического стресса клеточных культур.

В первой части работы мы провели исследование влияния VBIT4 – ингибитора VDAC на развитие митохондриальной дисфункции первичной культуры эндотелиоцитов легких мышей в условиях гипергликемии. Установлено, что экспозиция (36 часов) первичной культуры эндотелиоцитов легких мышей в среде с высоким содержанием глюкозы (30 мМ) приводит к достоверному снижению жизнеспособности клеток. 5 мкМ VBIT-4 устраняет цитотоксическое действие гипергликемии. Гипергликемия приводила к достоверному увеличению образования активных форм кислорода клетками, повышению активности спонтанного образования MPT поры в митохондриях, падению мембранного потенциала и увеличению колокализации митохондрий и лизосом (свидетельствует о возможности активации митофагии). Инкубация клеток в этих условиях с 5 мкМ VBIT-4 приводила к снижению генерации активных форм кислорода, подавлению открытия MPT поры и восстановлению колокализации митохондрий и лизосом.

В следующей части работы была получена культура фибробластов кожи человека с пониженной экспрессией VDAC1. Продемонстрировано, что клетки, со сниженной по VDAC1 экспрессией были практически не чувствительны к увеличению уровня глюкозы в среде до 30 мМ. Установлено, что в условиях гипергликемии наблюдается значительное увеличение флуоресценции DCF в фибробластах (в 1.97 раза). При снижении экспрессии VDAC1 также наблюдается рост флуоресценции, однако он менее выражен (в 1.67 раза). Это может свидетельствовать о том, снижение экспрессии VDAC1 может являться защитным механизмом при развитии гипергликемии. Продемонстрировано, что относительное снижение флуоресценции кальцеина в присутствии кобальта, индуцированное гипергликемией, в клетках с пониженной экспрессией VDAC1 менее выражено (в 1.18 раза) чем в случае немодифицированных клеток (в 1.35 раза).

Исходя из полученных результатов можно предположить, что фармакологическое или генетическое подавление активности VDAC1 в первичных культурах клеток является фактором, предотвращающим развитие митохондриальной дисфункции в условиях гипергликемического стресса клеток.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (20-15-00120).

Литература:

1. Skyler J.S., Bakris G.L., Bonifacio E., et al. Diabetes.2017, 66, 241-255.

2. Belosludtsev K.N., Belosludtseva N.V., Dubinin, M.V. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6559.

3. Zinghirino F., Pappalardo X.G., Messina A., et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7388.

4. Sasaki K., Donthamsetty R., Heldak M., et al. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2012, 303, C1055-60.

Diabetes mellitus is a metabolic disease associated either with a violation of insulin secretion by pancreatic cells (type I diabetes mellitus) or with insulin resistance of organs and tissues of the human and animal body (type II diabetes mellitus). As a result, hyperglycemia develops, which is accompanied by a violation of protein and lipid metabolism. These disorders lead to pathological changes in the organs and tissues of the body [1].

It is generally accepted that mitochondrial dysfunction is one of the processes involved in the development of diabetes mellitus at the cellular level. Indeed, for many organs and tissues, as well as cell lines, it has been demonstrated that diabetes mellitus or hyperglycemia leads to increased generation of reactive oxygen species by mitochondria, disruption of oxidative phosphorylation processes, and a drop in membrane potential. It is believed that this is due to a violation of the cellular quality control of mitochondria, the intracellular system responsible for mitophagy, mitochondrial biogenesis, and mitochondrial dynamics [2].

Mitochondrial metabolism requires efficient exchange of ions and metabolites between mitochondria and the cytoplasm across the outer mitochondrial membrane. This exchange is carried out with the help of voltage-dependent anion channels (VDAC). In this regard, it is not surprising that VDAC may be involved in a wide range of pathologies associated with mitochondria [3]. Thus, recent studies have shown that during the development of diabetes, there is an overexpression of the VDAC1 protein [2,4]. This suggests its possible role in the pathogenesis of this disease. In this regard, the aim of this work was to investigate the effect of pharmacological and genetic inhibition of VDAC on the development of mitochondrial dysfunction under conditions of hyperglycemic stress in cell cultures.

In the first part of the work, we studied the effect of VBIT4, a VDAC inhibitor, on the development of mitochondrial dysfunction in a primary culture of mouse lung endotheliocytes under conditions of hyperglycemia. It was established that the exposure (36 h) of the primary culture of mouse lung endothelial cells in a medium with a high glucose content (30 mM) leads to a significant decrease in cell viability. 5 μM VBIT-4 abolishes the cytotoxic effect of hyperglycemia. Hyperglycemia led to a significant increase in the formation of reactive oxygen species by cells, an increase in the activity of spontaneous formation of MPT pore in mitochondria, a drop in membrane potential, and an increase in colocalization of mitochondria and lysosomes (indicating the possibility of mitophagy activation). Incubation of cells under these conditions with 5 μM VBIT-4 resulted in a decrease in the generation of reactive oxygen species, suppression of the opening of the MPT pore, and restoration of colocalization of mitochondria and lysosomes.

In the next part of the work, a culture of human skin fibroblasts with a reduced expression of VDAC1 was obtained. It has been demonstrated that cells with decreased VDAC1 expression were practically insensitive to an increase in the level of glucose in the medium up to 30 mM. It was found that under conditions of hyperglycemia, there is a significant increase in DCF fluorescence in fibroblasts (1.97 fold). The decrease in VDAC1 expression was also accompanied by an increase in fluorescence, but it was less pronounced (1.67 fold). This may indicate that a decrease in VDAC1 expression may be a protective mechanism in the development of hyperglycemia. It has been demonstrated that the relative decrease in calcein fluorescence in the presence of cobalt, induced by hyperglycemia, in cells with reduced VDAC1 expression is less pronounced (1.18 fold) than in the case of unmodified cells (1.35 fold).

Based on the obtained results, it can be assumed that pharmacological or genetic suppression of VDAC1 activity in primary cell cultures is a factor preventing the development of mitochondrial dysfunction under conditions of hyperglycemic cell stress.

The work was supported by the Russian Science Foundation (20-15-00120).

References:

1. Skyler J.S., Bakris G.L., Bonifacio E., et al. Diabetes.2017, 66, 241-255.

2. Belosludtsev K.N., Belosludtseva N.V., Dubinin, M.V. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6559.

3. Zinghirino F., Pappalardo X.G., Messina A., et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7388.

4. Sasaki K., Donthamsetty R., Heldak M., et al. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2012, 303, C1055-60.