Искусственные липидные везикулы (липосомы) широко используются в качестве модельных мембранных систем в различных медико-биологических исследованиях. Среди причин интереса к искусственным липосомам - возможность их применения как модельной системы для исследования особенностей везикулярного транспорта и моделирования разнообразных мембранных процессов, активное внедрение в медицинскую практику в качестве средств доставки в диагностических и клинических приложениях.

В жидкокристаллическом состоянии компоненты оболочки везикул, молекулы бислоя, имеют высокую латеральную подвижность. Мембрана ведет себя как достаточно жидкая, текучая фаза, обладающая свойствами двумерной жидкости. Выяснение механизмов и закономерностей латеральной поверхностной диффузии компонентов биологических мембран, их связь с составом, фазовым состоянием бислоя, различными патологическими процессами является важной и актуальной задачей. При анализе разнообразных мембранных процессов крайне важны численные значения коэффициентов латеральной диффузии, которые характеризуют трансляционную подвижность молекул липидов и белков вдоль двумерной поверхности мембраны. Измерения характеристик латеральной диффузии помимо данных о молекулярной подвижности, дают возможность анализировать фазовое состояние мембраны, вязкость, структуру и функции, особенности взаимодействия между компонентами мембраны.

Среди методов исследования динамических свойств биомембран, в том числе липидных оболочек искусственных везикул, особое место занимает метод ядерного магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля (ЯМР ИГМП). Метод ЯМР ИГМП позволяет получать информацию о трансляционной подвижности в системе без внесение дополнительных макроскопических или микроскопических возмущений в систему в виде зондов или меток.

В работе исследована латеральная самодиффузия молекул фосфолипидов одно- и двухкомпонентных модельных мембран искусственных везикул методом ЯМР спектроскопии с импульсным градиентом магнитного поля. Измерения проводились на ядрах 1Н на частоте 400.22 МГц на спектрометре “AVANCE 400 III TM” (Bruker), оснащенном блоком импульсного градиента магнитного поля. Для измерения коэффициентов самодиффузии (КСД) использовалась импульсная последовательность «стимулированное эхо». Регистрировались диффузионные затухания интенсивностей отдельных линий ЯМР в Фурье-спектрах спинового эха диффундирующих молекул.

Образцы - суспензии одно- и двухкомпонентных липосом были приготовлены стандартным методом гидратации тонких липидных пленок из фосфолипидов соевого фосфатидилхолина (SPC) марки Липоид S100 и воды (H2O) в массовом соотношении 1:1, с добавлением контрастирующего парамагнетика в концентрации 0.73 весовых % и без него. В качестве контрастирующего агента для подавления сигнала от воды был использован содержащий гадолиний препарат ProHance, с молекулами гадотеридола как активного вещества в количестве 279,3 мг на 1 мл. В роли второго компонента мембран двухкомпонентных систем выступал холестерин (Сhol) в молярном соотношении 2:1 (SPC : Chol).

Применена новая методика спектроскопического анализа для подавления сигнала от воды при измерении латеральной диффузии липидов по сигналам ядер 1Н. Известный способ подавление стремительно затухающего сигнала от быстро диффундирующих молекул воды импульсами градиента магнитного поля комбинируется с подавлением сигнала от водной фазы путем ускорения ядерной магнитной релаксации протонов воды при добавлении контрастирующего агента – ионов гадолиния в качестве парамагнитного допинга. В результате соотношение интенсивностей сигналов в спектре ЯМР на ядрах водорода 1H изменилось, подобно методике ЯМР ИГМП с вращением образца под магическим углом. Сигнал от OH-групп заметно уменьшился, на спектре отчетливо видны линии протонов холиновых групп липидов и протонов углеводородных цепей. Таким образом удается исследовать диффузию непосредственно молекул липидов по затуханию соответствующих линий в 1Н ЯМР спектре.

Полученные диффузионные затухания для однокомпонентного бислоя носят простой одно-экспоненциальный характер в изученном интервале времен диффузии от 50 мсек до 250 мсек. Величина коэффициента латеральной диффузии при температуре 308 К и времени диффузии 50 мсек составляет 6,8*10 -14 м2/сек. В двухкомпонентной мембране с добавлением молекул холестерина диффузионные затухания носят сложный характер и описываются уравнением для многофазной системы, представляющим собой сумму экспоненциальных функций. Обнаружена зависимость коэффициентов латеральной диффузии липидов от времени диффузии. Данные факты можно объяснить фазовыми неоднородностями в бислое с холестерином (образованием липидных доменов – рафтов) при температуре эксперимента и как показано в работе [1], нелинейной зависимость между среднеквадратичным смещением и временем диффузии вследствие кривизны бислоев в везикулярной системе. При больших временах диффузии, в режиме ограниченной диффузии, средний квадрат смещений молекул достигает предельного значения, соответствующего размерам везикул. Рассчитанные на основе этих данных значения радиусов кривизны ламеллярных бислоев везикул согласуются с полученными нами данными методом конфокальной микроскопии.

1. Lateral Diffusion Rates of Lipid, Water, and a Hydrophobic Drug in a Multilamellar Liposome / H.C. Gaede, K. Gawrisch - DOI 10.1016/S0006-3495(03)74603-7 // Biophys J. – 2003. - Sep; 85(3) – p. 1734–1740.

Artificial lipid vesicles (liposomes) are widely used as model membrane systems in various biomedical studies. Among the reasons for interest in artificial liposomes is the possibility of their use as a model system for studying the features of vesicular transport and simulation of various membrane processes, active introduction into medical practice as a means of delivery in diagnostic and clinical applications.

In the liquid crystal state, the components of the vesicle envelope have a high lateral mobility. The membrane behaves as a rather liquid, fluid phase, which has the properties of a two-dimensional liquid. Explanation of the mechanisms and regularity of lateral surface diffusion of biological membrane components, their relationship with the composition, phase state of the bilayer, and various pathological processes is an important and of current interest task. When analyzing various membrane processes, the numerical values of the lateral diffusion coefficients, which characterize the translational mobility of lipid and protein molecules along the two-dimensional membrane surface, are extremely significant. Measurements of the characteristics of lateral diffusion, in addition to data on molecular mobility, make it possible to analyze the phase state of the membrane, viscosity, structure and functions, and features of the interaction between the membrane components.

Among the methods for studying the dynamic properties of biomembranes, including the lipid membranes of artificial vesicles, a special place has the method of nuclear magnetic resonance with pulsed magnetic field gradients (NMR PFG). The NMR PFG method makes it possible to obtain information about the translational mobility in the system without introducing additional macroscopic or microscopic perturbations into the system in the form of probes or labels.

In this work, the lateral self-diffusion of phospholipid molecules of one- and two-component model membranes of artificial vesicles was studied by NMR spectroscopy with a pulsed magnetic field gradient. The measurements were carried out on 1H nuclei at a frequency of 400.22 MHz on an AVANCE 400 III TM spectrometer (Bruker) equipped with a pulsed magnetic field gradient unit. To measure the self-diffusion coefficients (SDC), the pulse sequence "stimulated echo" is used. Diffusion attenuation of the intensities of individual NMR lines in the Fourier spectra of the spin echo of diffusing molecules recorded.

Samples - suspensions of one- and two-component liposomes were prepared by the standard method of hydration of thin lipid films from phospholipids of soybean phosphatidylcholine (SPC) brand Lipoid S100 and water (H2O) in a mass ratio of 1:1, with the addition of a contrasting paramagnet at a concentration of 0.73 wt% and without it. Gadolinium-containing contrast agent ProHance was used as a contrast agent to reduce the water signal, with Gadoteridol molecules as the active substance in the amount of 279.3 mg per 1 ml. Cholesterol (Chol) with a molar ratio of 2:1 (SPC : Chol) acts as the second component of the membranes of two-component systems.

A new method of spectroscopic analysis was applied to depress the signal from water when measuring the lateral diffusion of lipids using the signals of 1H nuclei. A well-known method of suppressing a rapidly decaying signal from rapidly diffusing water molecules by magnetic field gradient pulses is combined with signal reduction from the aqueous phase by accelerating the nuclear magnetic relaxation of water protons with the addition of a contrasting agent, gadolinium, as a paramagnetic doping. As a result, there is a change in the ratio of the signal intensities in the 1H NMR spectrum, similar to that in the PFG magic angle spinning NMR spectroscopy method. The signal from OH-groups noticeably decreases the lines of protons of choline groups of lipids and protons of hydrocarbon chains are clearly visible on the spectrum. Thus, it is possible to study the diffusion of lipid molecules directly from the attenuation of the corresponding lines in the 1H NMR spectrum.

The diffusion decays obtained for a one-component bilayer has a simple one-exponential character in the studied diffusion time interval from 50 ms to 250 ms. The value of the lateral diffusion coefficient at a temperature of 308 K and a diffusion time of 50 ms is 6.8*10 -14 m2/sec. In a two-component membrane with the addition of cholesterol molecules, diffusion decays are complex and described by an equation for a multiphase system, which is a sum of exponential functions. The dependence of the lateral diffusion coefficients of lipids on the diffusion time is found. These facts can be explained by phase heterogeneity in the bilayer with cholesterol (formation of lipid domains - rafts) at the experimental temperature and, as indicated in [1], the non-linear relationship between the average square of molecular displacement and diffusion time due to the curvature of the bilayers in the vesicular system. At long diffusion times, in the mode of limited diffusion, the average square of molecular displacement reaches a limiting value corresponding to the size of the vesicles. The values of the radii of curvature of the lamellar bilayers of vesicles calculated based on these data agree with our data obtained by confocal microscopy.



1. Lateral Diffusion Rates of Lipid, Water, and a Hydrophobic Drug in a Multilamellar Liposome / H.C. Gaede, K. Gawrisch - DOI 10.1016/S0006-3495(03)74603-7 // Biophys J. – 2003. - Sep; 85(3) – p. 1734–1740.