Популяция нейронов обонятельного эпителия позвоночных представляет собой матрицу хемосенсорных элементов, способных к распознаванию широкого спектра соединений. Способность к дифференцированному детектированию различных по химической природе веществ обеспечивается специализацией сенсорных клеток на уровне экспрессии обонятельных рецепторов (ОР), в свою очередь, определяющих направленность афферентных волокон в соответствующий отдел обонятельной луковицы. Молекулярной основой для избирательного распознавания обонятельных стимулов традиционно считается реализация принципа «один нейрон – один рецептор» в зрелых обонятельных нейронах. Механизмы избирательной экспрессии одного из многочисленных рецепторных генов (1360 у мыши, 816 – у человека, 811 – у псовых) детально не установлены. Предполагается, что в индивидуальном нейроне селекция гена рецепторного белка осуществляется за счет модификации гетерохроматина с участием деметилаз, привлечения транскрипционных факторов Lhx2 и Ebf, формирования внутри- и межхромосомных контактов, обеспечивающих доступность генетических локусов для транскрипции. Однако, данные транскриптомного анализа, указывают на возможность экспрессии нескольких (от 2 до 9) рецепторных генов в зрелых обонятельных нейронах. Эти результаты могут быть обусловлены автоматизированной сортировкой клеток, не исключающей присутствие в образце примесей мРНК соседних клеток. Применение метода, позволяющего избежать попадания примесей мРНК из соседних клеток в анализируемый образец, позволит обойти эту проблему. В представленной работе был усовершенствован метод получения диссоциированных жизнеспособных одиночных нейронов. Нами были отобраны одиночные зрелые нейроны, идентифицированные по присутствию маркера OMP. Из одиночных лизированных клеток была выделена тотальная кДНК, которая была использована для получения ПЦР-фрагментов с универсальными вырожденными праймерами к генам ОР. Продукты ПЦР соответствующей одиночной клетки были клонированы в плазмиду pJET1.2, т.е были созданы клонотеки, содержащие в составе вектора фрагменты белок-кодирующей области всех генов ОР, представленных в данной клетке. Для секвенирования использовано от 20 до 40 клонов для каждой клетки, что представляет репрезентативное количество для оценки гомогенности клонированных фрагментов. Идентификацию генов ОР проводили путем выравнивания нуклеотидных последовательностей отсеквенированных образцов клонотеки на геном Mus musculus (C57BL/6J, RefSeq GCF_000001635.27) с помощью ресурса BLAST.

Было проанализировано 10 индивидуальных обонятельных нейронов. Обнаружено три варианта представленности транскриптов в индивидуальном нейроне. В первом случае однозначно выявляется экспрессия одного рецептора. Во втором варианте детектируется два рецептора, с очевидным превалированием одного транскрипта. В третьем случае – обнаруживаются от двух до четырех рецепторов. Для этого варианта нейронов мажорные множественные транскрипты присутствуют в следующих сочетаниях: Or8k35 и Or4c109 (60,7 и 32,14 % соответственно); Or6z6 и Or4c116 (57,7 и 34,6%); Or4p8 и Or6z6 (68,4 и 21,1%); Or4e1 и Or4c113 (48 и 36%). В тех случаях, когда в нейроне обнаруживается один превалирующий вариант транскрипта гена ОР (второй вариант), соответствующие гены обладают как достаточно высоким уровнем экспрессии в популяции клеток, по данным Ibarra-Soria и соавт. - Or6p1, Or4c117, Or4e1, Or6z7, так и минимальным уровнем в случае гена Or4c113. Это указывает на высокую чувствительность метода детектирования транскриптов, использованного в данной работе. При множественной экспрессии генов ОР для пары Or6z6/Or4c116 ген Or6z6 при популяционном секвенировании превосходит по представленности транскриптов ген Or4c116 в 25 раз, в то время как в индивидуальной клетке - всего в 2 раза. Для пары Or4p8/Or6z6 наблюдается обратное соотношение: ген Or6z6, более активный в смешанной популяции, при одновременной экспрессии с другим сопутствующим партнером в отдельном нейроне представлен меньшим количеством продукта. В обоих случаях транскрипция Or6z6, локализованного на хромосоме 7, сопряжена с активацией генов Or4c116 либо Or4p8, расположенных на хромосоме 2. Хромосома 2 наиболее обогащена генами ОР, сгруппированными в три дистанцированных друг от друга кластера. Не исключено, что локус хромосомы 7, содержащий Or6z6, образует физические контакты в области протяженного кластера 38 на хромосоме 2, кодирующего 269 генов ОР, включая Or4c116 и Or4p8. Эти гены, удаленные друг от друга на 213 927 н.п., могут входить в состав одного структурного домена при образовании межхромосомных контактов, и возможна их активация синхронно с сопутствующим геном Or6z6 на хромосоме 7. Однако, характерный для индивидуальной клетки профиль экспрессии генов-партнеров, выбор которых продиктован структурными особенностями ДНК в области контактов, допускает альтернативные варианты сочетанной экспрессии. При вовлеченности в транскрипцию нескольких генов ОР, соотношение соответствующих мРНК зависит, скорее, от транскрипционного статуса единовременно экспрессируемых генов, нежели от индивидуальных особенностей каждого из них. Этот эффект может объясняться динамическими перестройками структуры хроматина, сопутствующими транскрипции, в области межхромосомных контактов и участков связывания регуляторных белков. Полученные результаты позволяют заключить, что в обонятельных нейронах могут экспрессироваться гены как одного, так и нескольких ОР, причем в мультирецепторных клетках выбор сопутствующего гена может носить не случайный характер.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант №22-24-00860.

The neuron population of the vertebrate olfactory epithelium may be considered as a matrix of chemosensory elements capable of detecting a wide range of compounds. The ability to differentiate substances diverse in chemical nature is provided by the fine turning of sensory cells at the level of olfactory receptors (OR) expression predetermining in fact correct afferent projections in corresponding bulbar zone. It remains generally accepted that the rule “one neuron – one receptor” lies in the basis of selective recognition of odorant stimuli. Mechanisms regulating the expression of unique gene from the set of multiple genes encoding olfactory receptors (1360 for mouse, 816 for human, 811 for the dog) are still not known in details being one of the most intriguing problems regarding managing of genome functions during maturation of neurons. Few ways are employed for OR selection and switching: heterochromatin modification by means of metilase, recruitment of transcription factors Lhx2 and Ebf , formation of inter- and intra-chromosomal contacts making certain genetic loci available for transcription. Nevertheless, the scRNAseq data allow to suppose the expression of 2 - 9 OR genes in mature olfactory neurons. These facts incompatible with dominating hypothesis could be considered as a consequence of automatic cell sorting, resulting in capturing of mRNA originated from neighbouring cells during sample preparation. Special efforts allowing avoiding the implication of concomitant RNA in the reactions could substantially improve the results. In present work we refined the procedure of isolation of single olfactory neurons from mouse olfactory epithelium. Mature neural cells were selected by the presence of OMP marker, subjected to preparation and total cDNA was synthesized from single cell lysate. cDNA was used as a template for PCR with degenerated oligonucleotide primers specified to broad range of OR.PCR fragments obtained from each cell were cloned in pJET1.2 vector used for transformation of E.coli, so that plasmid library is thought to contain protein-coding regions of all OR species expressed in given cell. Plasmids purified from 20 to 40 colonies containing the insert, were sequenced and the type of OR gene was determined using BLAST in the genome of Mus musculus (C57BL/6J, RefSeq GCF_000001635.27).

Totally 10 individual olfactory neurons were taken into analysis and three types of transcript distribution was observed. In the first case the expression of the singular OR was detected unambiguously. In the second one two OR transcripts appeared to be expressed with obvious prevalence of the major one. In the third case from two to four OR transcripts were detected. For the latter type major multiple transcripts were present in the following combinations: Or8k35 and Or4c109 (60,7 and 32,14 % correspondently); Or6z6 and Or4c116 (57,7 and 34,6%); Or4p8 and Or6z6 (68,4 and 21,1%); Or4e1 and Or4c113 (48 and 36%). In those cases when one prevalent OR gene was detected, it may belong to the group of highly expressed genes according to populational RNAseq available from Ibarra-Soria and co-authors, - Or6p1, Or4c117, Or4e1, Or6z7, as well as tends to possess only trace expression in the case of Or4c113. The detection of weakly transcribed mRNA confirms rather high sensitivity of the approach used in this study. Or6z6 transcript, being co-expressed with Or4c116 in single cell, exceeds it’s counterpart 2-fold whereas in mixed population it’s level is shown to be 25-fold higher. For the pair Or4p8/Or6z6 the opposite ratio is observed: Or6z6 being more active in mixed population, upon concomitant expression with Or4p8 is presented as less abundant product. In both cases transcription of Or6z6 located on Chromosome 7 is obviously coupled with activity of genes Or4c116 or Or4p8 nested in Chromosome 2. The latter is enriched by OR genes subgroupped in 3 remote clusters. One cannot exclude that locus of Chromosome 7 bearing Or6z6 is able to form physical contacts with Chromosome 2 in the area of long cluster 38 containing 269 OR genes including Or4c116 and Or4p8. These genes separated by 213 927 bp may participate in the formation of the same structural domain by means of inter-chromosomal contacts between Chromosome 2 and Chromosome 7 and due to spatial proximity may be expressed along with Or6z6. Individual pattern of OR co-expression observed in given cell is determined by DNA structural features in the vicinity of inter-chromosomal nodes and alternative modes of concomitant expression with the prevalence one or another OR gene may arise in different cells. When more than one OR gene is involved in transcription in certain cell the ratio of corresponding mRNA species depends likely on transcriptional status of simultaneously expressing genes rather than on individual properties of each one per se. This effect may be relayed on transcription-driven dynamical rearrangements of chromatin structure in the regions of inter-chromosomal contacts and regulatory factor’s binding. The results of this study allow to suggest that olfactory neurons are capable to express one as well as few OR genes and in multy-receptor cells the choice of the partner gene seems to be not occasional.

This work was supported by Russian Science Foundation, project №22-24-00860.