Ключевые слова: T.aestivum, конфокальная лазерная микроскопия, митохондрии, пульсации трансмембранного потенциала (Δψm), ′митофлеши′ АФК, подвижность, холодовая адаптация



Митохондрии, как известно, осуществляют свою мультифункциональную роль в поддержании и регуляции клеточных процессов во многом благодаря уникальным свойствам внутренней мембраны, в первую очередь способностью генерировать высокий трансмембранный потенциал (ΔѰm). Наряду с энергообеспечением, модуляция ΔѰm может быть задействована в системе клеточного сигналинга и проявляться в высокоамплитудных флуктуациях интенсивности флуоресценции специфических красителей, позволяющих детектировать изменения ΔѰm и генерации активных форм кислорода (АФК) на уровне индивидуальных органелл в режиме реального времени, как правило, в секундных диапазонах. Динамические феномены, названные пульсациями ΔѰm (′pulsing′) , были обнаружены с помощью производных тетраметилродамина (TMRM) еще в конце ХХ века [1], тогда как часто ассоциированные с ними «вспышки» (′mitoflashes′) флуоресценции АФК-детектирующих систем - относительно недавно [2]. На данный момент природа динамических феноменов, в том числе триггерные механизмы, остаются во многом непонятыми.

В данной работе исследовали зависимость динамических событий от мобильности митохондрий; в качестве контрольных объектов исследований были использованы колеоптили этиолированных проростков озимой пшеницы (T. aestivum L., сорт Мироновская 808), выращенных при 23-25oC (3 сут)(контроль), часть которых подвергались холодовой акклимации (0-4oС, 5 сут)(опыт). Образцы срезов тканей окрашивали 0.5 µM TMRM или совместно с 10 µM DCFH2DA, просматривали в Zeiss LSM META 510 с последующим мультитрековым анализом в ImageJ (Fiji) c помощью программы TrackMate v6.0.1 [3]. Для количественной оценки параметров мобильности митохондрий (скорость, направление и топография транслокации, трансформация морфологии) использовали time-lapse серии фреймов (3 мин) области интересов (ROI) площадью 2000-3000 мкм2 с временным разрешением 0.8 мс/пиксель (500 мс/фрейм).

Исходя из данных трекинг-анализа индивидуальных митохондрий контроля, органеллы были условно отнесены к 3 субпопуляциям по скорости и характеру движения - «бегущие», «бродячие» и «сидячие». Перемещение органелл за 3мин мониторинга составило более 10 мкм у «бегущих», 1-10 мкм и менее 1 мкм - у «бродячих» и «сидячих», соответственно. «Сидящие» органеллы с минимальной подвижностью составляли практически половину от общего числа митохондрий в ROI и характеризовались более высокой pulsing-активностью (80% от общего числа событий) по сравнению с мобильными. Интересно отметить, что в момент пульсации скорости движения мобильных органелл резко снижались до уровня таковых «сидячей» субпопуляции. «Обездвиживание» митохондрий антицитоскелетным агентом латранкулин В (300 нм) также увеличивало pulsing-активность образцов. Факты усиления пульсирующей активности в момент остановки органелл позволяют предположить, что в субкортексе клеток могут существовать сайты реорганизации и/или модификации мембранных компонентов оболочки митохондрий, которые ведут к образованию врѐменных поровых каналов, детектируемых по быстрому и обратимому характеру выброса из органелл ТМRМ вследствие транзиторного падения Δψm. Последнее часто, но не всегда, сопровождалось «вспышками» внутримитохондриального окисления DCFH2, связанного с генерацией АФК.

После длительной холодовой адаптации отмечали увеличение интенсивности флуоресценции TMRM почти в 2 раза, обусловленное ΔѰm-зависимым накоплением данного красителя на фоне снижения pulsing-активности и возрастания степени плеоморфности митохондрий. При этом сложные нерегулярные формы органелл характеризовались преимущественно амебоидным типом двигательного поведения, параметры динамичности которого пока трудно количественно оценить.

Заключили, что подавление pulsing-активности митохондрий при холодовой адаптации отражает уменьшение реактивности систем жизнеобеспечения клеток на действие возмущающих факторов, что может быть критичным для их выживаемости. Обнаруженная индукция пульсаций при остановке движения органелл при оптимальных температурных условиях, а также общее снижение количества событий при гипотермии указывают скорее всего на системную, а не строго стохастическую, как постулируется в литературе, природу изучаемых динамических феноменов.



Список литературы

1. Loew L.M.,Tuft R.A.,Carrington W., et al.//Biophysical journal.1993.65(6),2396-2407.

2. Wang W.,Fang H.,Groom L., et al.//Cell.2008.134,279–290.

3. Tinevez J.-Y.,Perry N.,Schindelin J., et al.//Methods.2017.115,80–90.

Key words: T.aestivum, confocal laser microscopy, mitochondria, transmembrane potential (Δψm) pulsing, ROS mitoflashes, mobility, cold acclimation

Mitochondria as well-known fulfill a multifunctional role in a maintenance and regulation of the cell processes mainly due to the unique properties of the inner membrane, first of all the ability to generate transmembrane potential (Δψm). Along with energy supply, fluctuations of Δψm might be involved into cell signaling systems because of their transitory high-amplitude sharp and short-time (in the second range) character. Such dynamic events termed as 'pulsings' or 'flickerings' of Δψm were revealed using tetramethyl rhodamine derivates (TMRM) at the end of 20th century [1]. Often coupled with these, reactive oxygen species (ROS) flashes or 'mitoflashes' were detected recently [2]. To date, nature of the dynamic phenomena, including triggering mechanisms, remains mainly obscure.

We researched the dependence the frequency of mitochondrial dynamic events on the motility of the organelles in the coleoptile cells of wheat seedlings (T.aestivum) that were grown in the dark (23-25oC, 3d) and then cold acclimated (0-4oС, 5d). Samples of tissue slices were dyed by 0.5 µM TMRM or/and 10 µM DCFH2DA, and their vital microscopy was conducted by the use of LSM510 META (Carl Zeiss MicroImaging) with subsequent multi-tracking analysis (ImageJ (Fiji), Track-Mate v6.0.1) [3]. For quantitative estimation of mitochondrial mobility parameters (traffic velocity, direct and topography of translocation, morphology transformation), we applied a frame time-lapse series received by real-time monitoring for 3 min in 2000-3000 μм2 (ROI) with temporal resolution being 0.8 мs/pixel (500 мs/frame).

According to single-organelle tracking analysis, the chondriome was relatively divided into 3 subpopulations, namely ′running′ (more than 10 µm distance traveled for 3 min), ′walking′ (1-10 µm) and ′sitting′ (less than 1 µm) ones. The high pulsing activity (80% from the total events) was inherent mainly for non-mobile mitochondria (′sitting′) which percentage was 55% from the organelle total number in ROI . It should be stressed that at the moment when the pulsing events were happen, velocity speeds of the mobile mitochondria declined sharply and became common with those of ‘sitting’ ones. Interestingly, mitochondrial 'immobilization' by the anti-cytoskeletal agent latrunculin (300 nm) also increased the pulsing activity. These facts allow to propose being of the cell sub-cortex sites of reorganizing and/or modifying of mitochondrial membrane components to result in a formation of the transient pore channels that detected in a sudden and reversible manner of TMRM emission due to Δψm dissipation. The latter was often, but not at every turn, accompanied by flashing of intramitochondrial oxidation of DCFH2, widely applicable ROS-detecting indicator.

After long-term cold acclimation, TMRM fluorescence intensity in mitochondria increased up to 2 times evoked by ΔѰm-dependent accumulation of this dye with simultaneous decline of the pulsing-activity. Moreover, morphological heterogeneity of the chondriome increased, and complex irregular-shape mitochondria were characterized by mainly amoeboid-type of motility behavior which dynamic parameters were difficult to quantitatively estimate.

Thus, the pulsing-activity decreasing under cold acclimation reflects, on our opinion, inhibition of life- support system reactivity in response to perturbing factors that could be critical for cell survival. Detected pulsing induction under the stopping of mitochondrial traffic (growth optimal temperature), also the total reduction of the flash events (long-term hypothermia) indicate on more systemic then strictly stochastic as postulated in literature nature of the dynamic phenomena.



Reference

1. Loew L.M.,Tuft R.A.,Carrington W., et al.//Biophysical journal.1993.65(6),2396-2407.

2. Wang W.,Fang H.,Groom L., et al.//Cell.2008.134,279–290.

3. Tinevez J.-Y.,Perry N.,Schindelin J., et al.//Methods.2017.115,80–90.