VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Биофизика клетки. Мембранные и транспортные процессы

Исследование ингибирования эндоцитоза как возможного терапевтического подхода для предотвращения развития реперфузионного повреждения

А.В. Степанов1*, Ю.А. Филиппов1, Е.В. Новикова1, М.Г. Добрецов1, И.В. Кубасов1

1.Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Россия;

* botanik2407(at)gmail.com

Некроз и разрушение плазматической мембраны кардиомиоцитов ишемической зоны при инфаркте миокарда ведет к высвобождению в межклеточное тканевое пространство многочисленных компонентов поврежденных клеток. Фрагменты ДНК, провоспалительные цитокины, факторы апоптоза, множество биоактивных молекул, синтезированных в ответ на ишемический стресс, а также более крупные компоненты погибших клеток распространяются в межклеточной среде и с кровотоком при реперфузии в соседние, не поврежденные ишемией зоны миокарда. Там они негативным образом могут воздействовать на здоровые миоциты, поглощаясь этими клетками путем эндоцитоза, что, в свою очередь, может запускать каскады цитотоксических реакций, сходные с теми, что явились причиной гибели клеток в ишемической зоне. Хотя многие клеточные и молекулярные процессы, происходящие на границе с ишемизированной зоной миокарда, активно исследуются, вклад эндоцитоза в распространение сигналов повреждения в интактной зоне остаётся неизученным. Таким образом, цель данной работы заключалась в исследовании подавления эндоцитоза как возможного терапевтического подхода для предотвращения развития реперфузионного повреждения и, как следствие, развития обширного инфаркта миокарда.

Работа проводилась на крысах самцах линии Wistar. В качестве экспериментальной модели была выбрана модель ишемии миокарда левого желудочка, вызванная лигированием левой коронарной артерии (45 мин), с последующей реперфузией (ИР). У ложнооперированных крыс (ЛО) производилось вскрытие грудной клетки без коронароокклюзии. Для подавления эндоцитоза у крыс с ИР применялся блокатор хлорпромазин (ХП) (0,5 мг/кг).

Оценка размера рубца через 2-4 недели после ИР производилась на поперечных срезах (5-7 срезов) левого желудочка, окрашенных трифенилтетразолием хлористым.

Электрофизиологическое исследование проводилось на изолированных сердцах, перфузируемых раствором Тироде, с использованием метода микроэлектродной внеклеточной регистрации (loose patch метод, диаметр кончика микроэлектрода ~ 5 µм, сопротивление ~ 2 МОм).

Исследование распределения т-трубочек кардиомиоцитов осуществлялось с использованием конфокальной микроскопии (конфокальный микроскоп Leica TCS SP5) на изолированных сердцах, окрашенных флуоресцентным красителем Di-8-ANEPPS (20 µМ).

Анализ зон некроза на поперечных срезах сердца через 2 и 4 недели после операции не выявил достоверных отличий в доле рубцовой ткани между группой ИР-крыс и группой ИР/ХП-крыс (соответственно 24,5±6,5% и 34,8±7,1% на 2-й неделе и 28,9±3,3% и 29,8±6,1% на 4-й неделе).

Исследование организации Т-тубулярного аппарата с использованием конфокальной микроскопии не выявило достоверных различий длин интервалов между соседними т-трубочками и частотой встречаемости длинных (более 3 µм) интервалов как между группами контрольных и ИР-крыс, так и между группами ИР- и ИР/ХП-крыс.

Электрофизиологическое исследование показало, что в группе ИР-крыс по сравнению с группой ЛО-крыс наблюдается существенное ремоделирование профилей внеклеточных потенциалов действия (вПД) первого типа (с одним негативным пиком), регистрируемых в зоне мембраны кардиомиоцитов, свободной от входов в т-трубочки. Происходило градуальное увеличение их времени спада и формирование фазы следовой гиперполяризации. Одновременно у вПД второго типа (с двумя негативными пиками), регистрируемых в зоне мембраны кардиомиоцитов субэпикарда, имеющей входы т-трубочек, наблюдалось достоверное выраженное снижение амплитуды и длительности второго пика.

Представленные данные позволяют предположить, что эти изменения ассоциированы с увеличением активности/экспрессии Ca2+-зависимых калиевых каналов низкой проводимости (SK каналы), поскольку применение селективного ингибитора SK каналов апамина (500 нМ) приводило к исчезновению фазы следовой гиперполяризации.

На фоне применения ХП характеристики вПД первого и второго типов в группе ИР/ХР-крыс достоверно не отличались от значений, регистрируемых у ЛО-крыс. Это свидетельствует в пользу того, что краткосрочное подавления эндоцитоза существенно ослабляет ремоделирование вПД после ИР.

Размеры инфарктной зоны достоверно не отличались между собой в ИР- и ИР/ХР-группах. Это указывает на то, что сигналы повреждения существенно не влияют на размеры некротической зоны, но оказывают эффект на процессы ремоделирования электрогенеза в плазматической мембране кардиомиоцитов субэпикарда.

Работа выполнена в рамках государственного задания № 075-00967-23-00 и при частичной поддержке гранта РФФИ № 20-34-90010.

Investigation of endocytosis inhibition as a possible therapeutic approach to prevent the development of reperfusion injury

A.V. Stepanov1*, Yu.A. Filippov1, E.V. Novikova1, M.G. Dobretsov1, I.V. Kubasov1

1.Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of RAS, Saint Petersburg, Russia;

* botanik2407(at)gmail.com

Necrosis and destruction of the plasma membrane of cardiomyocytes in the ischemic zone during myocardial infarction leads to the release of numerous components of damaged cells into the intercellular tissue space. DNA fragments, pro-inflammatory cytokines, apoptosis factors, many bioactive molecules synthesized in response to ischemic stress, as well as larger components of dead cells, are distributed in the intercellular environment and by the bloodstream during reperfusion to adjacent myocardial zones not damaged by ischemia. There, they can negatively affect healthy myocytes, being absorbed by these cells by endocytosis, which, in turn, can trigger cascades of cytotoxic reactions similar to those that caused cell death in the ischemic zone. Although many cellular and molecular processes that occur at the border with the ischemic zone of the myocardium are actively studied, the contribution of endocytosis to the propagation of damage signals in the intact zone remains unexplored. Thus, the aim of this work was to investigate the suppression of endocytosis as a possible therapeutic approach to prevent the development of reperfusion injury and, as a consequence, the development of extensive myocardial infarction.

The work was carried out on Wistar male rats. The model of left ventricular myocardial ischemia caused by ligation of the left coronary artery (45 min) followed by reperfusion (IR) was chosen as an experimental model. In sham-operated rats (SO), the chest was opened without coronary occlusion. To suppress endocytosis in rats with IR, the blocker chlorpromazine (CP) (0.5 mg/kg) was used.

The scar size was assessed in 2-4 weeks after IR on transverse sections (5-7 sections) of the left ventricle stained with triphenyltetrazolium chloride.

An electrophysiological study was performed on isolated hearts perfused with Tyrode's solution using the microelectrode extracellular recording method (loose patch method, microelectrode tip diameter ~ 5 µm, resistance ~ 2 MΩ).

The distribution of t-tubules of cardiomyocytes was studied using confocal microscopy (Leica TCS SP5 confocal microscope) on isolated hearts stained with Di-8-ANEPPS fluorescent dye (20 µM).

Analysis of necrosis zones on transverse sections of the heart in 2 and 4 weeks after surgery did not reveal significant differences in the proportion of scar tissue between the group of IR rats and the group of IR/CP rats (24.5±6.5% and 34.8±7.1%, respectively, at week 2 and 28.9±3.3% and 29.8±6.1% at week 4).

The study of the organization of the T-tubular system using confocal microscopy did not reveal significant differences in the length of the intervals between adjacent t-tubules and the frequency of occurrence of long (more than 3 µm) intervals both between groups of control and IR rats, and between groups of IR and IR/CP rats.

An electrophysiological study showed that there was a significant remodeling of the profiles of type 1 extracellular action potentials (EAPs) (with one negative peak) recorded in the zone of the cardiomyocyte membrane free from entrances to the t-tubules in the group of IR rats, compared to the group of SO rats. There was a gradual increase in their decay time and the formation of the afterhyperpolarization phase. Simultaneously, in type 2 EAPs (with two negative peaks) recorded in the membrane zone of subepicardial cardiomyocytes which has t-tubule entrances a significant pronounced decrease in the amplitude and duration of the second peak was observed.

The presented data suggest that these changes are associated with an increase in the activity/expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK channels), since the use of the selective SK channel inhibitor apamin (500 nM) led to the disappearance of the afterhyperpolarization phase.

Along with the use of CP, the characteristics of type 1 and type 2 EAPs in the group of IR/CR rats did not differ significantly from the values recorded in the SO rats. This suggests that short-term suppression of endocytosis significantly attenuates EAP remodeling after IR.

The size of the infarction zone did not differ significantly between the IR and IR/CP groups. This indicates that damage signals do not significantly affect the size of the necrotic zone, but have an effect on the processes of electrogenesis remodeling in the plasma membrane of subepicardial cardiomyocytes.

The work is supported by the IEPhB Research Program 075-00967-23-00 and IEPhB Research Resource Center and in the part by Russian Foundation for Basic Research grant № 20-34-90010.


Докладчик: Степанов А.В.
312
2022-10-31

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists