Для эффективного ответа на изменяющиеся факторы внешней среды у растений существует сложная система генерации и передачи стрессовых сигналов. Известно, что при действии повреждающего стимула происходит распространение такого электрического сигнала как вариабельный потенциал (ВП) и изменение содержания стрессовых фитогормонов. По данным литературы, генерация ВП связана со значительным изменением концентраций различных ионов, что может являться возможным индуктором изменения концентраций гормонов. Вероятное участие пероксида водорода (H2O2) в распространении ВП дает основу для предположения, что изменение концентрации H2O2 также играет роль в изменении содержания фитогормонов. Таким образом, целью работы явился анализ участия протонов, ионов кальция и пероксида водорода в изменении содержания фитогормонов при распространении электрических сигналов.

Исследования были выполнены на растениях пшеницы (Triticum aestivum L.) возрастом 15-19 дней. В качестве локального раздражителя для генерации ВП использовали постепенный нагрев кончика листа. Многоканальную макроэлектродную установку использовали для регистрации ВП. Исследование динамики концентраций протонов, ионов кальция и пероксида водорода при распространении ВП проводили на установке поверхностного оптического имиджинга с использованием флуоресцентных зондов BCECF, AM, Fluo-4, AM, Ampliflu Red, соответственно. Для загрузки зондов в растения был применен метод вакуумной инфильтрации. Определение содержания фитогормонов производили в удаленном от зоны воздействия фрагменте листа с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии. При пробоподготовке фрагмент листа растирали в жидком азоте, затем проводили процедуру гомогенизации в экстрагирующем растворе (80% раствор метанола + 1% муравьиной кислоты, содержащий внутренние стандарты исследуемых веществ). Экстракцию проводили в два этапа по 15 минут, затем центрифугировали при 20040 g, надосадочную жидкость с помощью испарителя-концентратора упаривали в 2 раза. Ингибиторный анализ проводили с помощью метода вакуумной инфильтрации растений пшеницы раствором 5мМ Na3VO4 (ингибитор протонной помпы) или 5 мМ LaCl3 (блокатор кальциевых каналов), для контрольной группы проводили вакуумную инфильтрацию раствором без добавления ингибиторов.

При действии постепенного нагрева наблюдается генерация и распространение ВП, а также изменение содержания фитогормонов в растениях пшеницы. Показано, что максимальная амплитуда изменения концентрации стрессовых фитогормонов, а именно жасмоновой кислоты (ЖК) наблюдается спустя 15 мин после действия стимула, а для абсцизовой кислоты (АБК) и салициловой кислоты (СК) характерны максимумы концентраций через 60 и 40 мин соответственно. При генерации ВП наблюдается временное закисление цитоплазмы. Ингибиторный анализ показал снижение амплитуды волны pH и амплитуды ВП при действии Na3VO4. Ингибирование протонного насоса оказывает влияние и на концентрации исследуемых фитогормонов: при действии Na3VO4 увеличивается содержание АБК и жасмонатов как при раздражении, так и в покое. Внутриклеточная концентрация Ca2+ временно повышается при генерации ВП. При проведении ингибиторного анализа также было показано, что при ингибировании кальциевых каналов происходит снижение амплитуды ВП, а также наблюдаются изменения в сдвигах концентраций фитогормонов, индуцированных действием на растение повреждающего стимула. При действии LaCl3 происходит блокировка увеличения содержания жасмонатов во временной точке 15 мин и СК во временной точке 60 мин после действия повреждающего стимула.

При генерации ВП также наблюдается временное повышение концентрации H2O2. При искусственном добавлении H2O2 происходят изменения содержания фитогормонов: концентрация СК статистически значимо увеличивается при действии 5мМ H2O2, при увеличении концентрации H2O2 до 20 мМ эффект оказывается еще более выраженным по сравнению с контрольной группой. Изменение содержания производного ЖК, жасмонил-изолейцина, происходит при действии 10 мМ H2O2. Динамика концентрации фитогормонов при действии локального раздражителя сопоставима с динамикой содержания гормонов при искусственном добавлении 10 мМ H2O2: показано, что концентрации АБК и СК увеличиваются во временной точке 45 мин после добавления H2O2, а для жасмонатов характерен значительный рост концентрации в точке 15 мин.

Таким образом, ингибиторный анализ показал участие протонов и ионов кальция в изменении параметров ВП, а также в вызываемом ВП сдвиге концентраций исследуемых стрессовых фитогормонов при действии локального раздражителя, показано участие изменения концентрации пероксида водорода в изменении содержания фитогормонов, что свидетельствует о возможном наличии связи между электрическими сигналами, изменением концентрации пероксида водорода, и гормональными сигналами.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 22-14-00388).

For an effective response to changing environmental factors, plants have a complex system of generation and propagation of stress signals. It is known that under the action of a damaging stimulus, such an electrical signal as a variable potential (VP) propagates and there is a change in the content of stress phytohormones. According to the literature, VP generation is associated with a significant change in the concentrations of various ions, which may be a possible inducer of changes in hormone concentrations. The probable involvement of hydrogen peroxide (H2O2) in the propagation of VP provides a basis for the assumption that the change in the concentration of H2O2 also plays a role in the change in the content of phytohormones. Thus, the aim of the work was to analyze the participation of protons, calcium ions, and hydrogen peroxide in the change in the content of phytohormones during the propagation of electrical signals.

For the experiments, 15-19-day old wheat plants (Triticum aestivum L.) were used. Heating of the leaf tip was used as a local stimulus to generate VP. A multichannel macroelectrode setup was used to record VP. The study of the dynamics of the concentrations of protons, calcium ions, and hydrogen peroxide during the propagation of VP was carried out on a surface optical imaging setup using BCECF, AM, Fluo-4, AM, and Ampliflu Red fluorescent probes, respectively. The vacuum infiltration method was used to load probes into plants. Determination of the content of phytohormones was carried out in a leaf fragment remote from the damage zone using the method of high-performance liquid chromatography-mass spectrometry. During sample preparation, a leaf fragment was frozen in liquid nitrogen and was homogenized in an extracting solution (80% methanol + 1% formic acid containing internal standards of the substances under study). The extraction was carried out in two stages for 15 minutes, then centrifuged at 20040 g, the supernatant liquid was evaporated 2 times using a concentrator. The inhibitory analysis was performed using the method of vacuum infiltration of wheat plants with a solution of 5 mM Na3VO4 (proton pump inhibitor) or 5 mM LaCl3 (calcium channel blocker); for the control group, vacuum infiltration was performed with a solution without the addition of inhibitors.

Under the action of heating, the generation and propagation of VP, as well as a change in the content of phytohormones in wheat plants, is observed. It was shown that the maximum amplitude of changes in the concentration of stress phytohormones, namely, jasmonic acid (JA), is observed 15 min after the stimulus, while abscisic acid (ABA) and salicylic acid (SA) are characterized by concentration maxima after 60 and 40 min, respectively. During VP generation, temporary acidification of the cytoplasm is observed. Inhibitory analysis showed a decrease in the amplitude of the pH wave and the amplitude of the VP under the action of Na3VO4. Inhibition of the proton pump also affects the concentrations of the studied phytohormones: under the action of Na3VO4, the content of ABA and jasmonates increases both during stimulation and without a stimulus. The intracellular concentration of Ca2+ temporarily increases during VP generation. Inhibitor analysis also showed that inhibition of calcium channels leads to a decrease in the VP amplitude, and changes in the shifts in phytohormone concentrations induced by the action of a damaging stimulus on the plant are also observed. The action of LaCl3 leads to blocking of the increase in jasmonates at the time point of 15 min and SA at the time point of 60 min after the action of the damaging stimulus.

During VP generation, a temporary increase in the H2O2 concentration is also observed. With the artificial addition of H2O2, changes in the content of phytohormones occur: the concentration of SA increases statistically significantly under the action of 5 mM H2O2, with an increase in the concentration of H2O2 to 20 mM, the effect is even more pronounced compared to the control group. A change in the content of the JA derivative, jasmonyl-isoleucine, occurs under the action of 10 mM H2O2. The dynamics of the phytohormone concentration under the action of a local stimulus is comparable to the dynamics of the hormone content upon the artificial addition of 10 mM H2O2: it was shown that the concentrations of ABA and SA increase at a time point of 45 min after the addition of H2O2, while jasmonates are characterized by a significant increase in concentration at a point of 15 min.

Thus, the inhibitory analysis showed the participation of protons and calcium ions in the change in VP parameters, as well as in the shift in concentrations of the studied stress phytohormones under the action of a local stimulus, caused by VP; which indicates a possible connection between electrical signals, changes in the concentration of hydrogen peroxide, and hormonal signals.

The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project № 22-14-00388).