Изучение термодинамики внутриклеточных процессов является новым направлением в науке, прогресс которого критически зависит от создания инструментария, способного прецизионно наводить и измерять температурные градиенты в микро/наноскопических объемах внутри и вблизи живых клеток. Такой ультралокальный термометр-нагреватель (ТН) на основе люминесцирующего наноалмаза, локализованного на торце стеклянного микрокапилляра, был недавно нами разработан [1]. Термочувствительность ТН обеспечивается ансамблем центров окраски “кремний-вакансия” (SiV-центр), встроенных в кристалл в процессе синтеза. Положение максимума бесфононной линии SiV-флуоресценции зависит от температуры и позволяет регистрировать температуру любой микро-/наносистемы после предварительной калибровки.

В качестве первого примера применения алмазного ТН в ультралокальной термической стимуляции мы продемонстрировали изменение уровня свободного внутриклеточного кальция в отдельных раковых клетках HeLa и первичной культуры нейронов [2], а также нейробластоме и кардиомиоцитах H9C2. Было обнаружено, что локальное повышение температуры на 12 °C относительно уровня окружающей среды (22 °C) в объеме ~1-3 мкм3 вблизи плазматической мембраны инициирует высвобождение кальция из внутриклеточных компартментов в цитоплазму и запускает каскад физиологических процессов.

Эффективность применения алмазного ТН в ультралокальной термометрии продемонстрирована на примере обнаружения температурного скачка вблизи микронных кластеров митохондрий в водной среде при разобщении электрон-транспортной цепи [3]. Эксперименты показали, что сброс мембранного потенциала при добавлении разобщителя CCCP приводит к выделению тепла митохондриями в диапазоне от 4 до ~ 22 °C по сравнению с уровнем окружающей среды (22 °C), с абсолютным максимумом 45 °C. Спонтанные температурные всплески с сопоставимой амплитудой были также обнаружены до аппликации разобщителя, что может отражать участие некоторых митохондрий 1) в синтезе АТФ или 2) утечку мембранного потенциала во избежание гиперпродукции активных форм кислорода.

Предлагаемый новый подход открывает беспрецедентные возможности для микро- и наномасштабной тепловой инициации физиологических процессов в живых клетках, а также модуляции их скорости в различных внутриклеточных компартментах.



ЛИТЕРАТУРА



1. A. M. Romshin, V. Zeeb, A.K. Martyanov, O.S. Kudryavtsev, D.G. Pasternak, V.S. Sedov, V.G. Ralchenko, A.G. Sinogeykin, I.I. Vlasov, A new approach to precise mapping of local temperature fields in submicrometer aqueous volumes, Sci. Rep., vol. 11, no. 1, p. 14228, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41598-021-93374-7.

2. A.M. Romshin, V. Zeeb, E. Glushkov, A. Radenovic, A.G. Sinogeikin, I.I. Vlasov. A new method for ultra-local thermal control of a single living cell, arXiv: arXiv.2206.14890 (2022).

3. Romshin, A. M., Osypov, A. A., Popova, I. Y., Zeeb, V. E., Sinogeykin, A. G., Vlasov, I. I. Heat release by isolated mouse brain mitochondria detected with diamond thermometer. Nanomaterials, 13(1), 98, Jan. 2023, doi: 10.3390/nano13010098.

The study of the thermodynamics of intracellular processes is a novel direction in science, the progress of which critically depends on the creation of tools capable of accurately inducing and measuring temperature gradients in micro-/nanoscopic volumes inside and near living cells. Such an ultralocal heater-thermometer(HT) based on a luminescent nanodiamond localized at the end of a glass microcapillary was recently developed by us [1]. The thermal sensitivity of HT is provided by an ensemble of “silicon vacancy” color centers (SiV center) embedded in the crystal during synthesis. The position of the maximum of the SiV fluorescence zero phonon line depends on temperature and allows recording the temperature of any micro-/nanosystem after preliminary calibration.

As the first example of the use of diamond HT in ultralocal thermal stimulation, we demonstrated changes in the level of free intracellular calcium in individual HeLa cancer cells and primary neuron culture [2], as well as neuroblastoma and H9C2 cardiomyocytes. It was found that a local temperature increase of 12 °C relative to the ambient level (22 °C) in a volume of ~1-3 µm^3 near the plasma membrane initiates the release of calcium from intracellular compartments into the cytoplasm and triggers a cascade of physiological processes.

The effectiveness of using diamond HT in ultralocal thermometry is demonstrated by the example of detecting a temperature burst near micron clusters of mitochondria in an aqueous medium under uncoupling of the electron transport chain [3]. Experiments have shown that during total uncoupling of transmembrane potential by CCCP application the temperature near mitochondria rises by 4-22 °C above the ambient temperature, with an absolute maximum of 45 °C. Spontaneous temperature bursts with the comparable amplitude were also detected prior to CCCP application that can reflect involvement of some mitochondria to ATP synthesis or membrane potential leaking to avoid hyperproduction of reactive oxygen species.

The proposed novel approach opens up unprecedented opportunities for micro- and nanoscale thermal initiation of physiological processes in living cells, as well as modulation of their rate in various intracellular compartments.



REFERENCES



1. A. M. Romshin, V. Zeeb, A.K. Martyanov, O.S. Kudryavtsev, D.G. Pasternak, V.S. Sedov, V.G. Ralchenko, A.G. Sinogeykin, I.I. Vlasov, A new approach to precise mapping of local temperature fields in submicrometer aqueous volumes, Sci. Rep., vol. 11, no. 1, p. 14228, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41598-021-93374-7.

2. A.M. Romshin, V. Zeeb, E. Glushkov, A. Radenovic, A.G. Sinogeikin, I.I. Vlasov. A new method for ultra-local thermal control of a single living cell, arXiv: arXiv.2206.14890 (2022).

3. Romshin, A. M., Osypov, A. A., Popova, I. Y., Zeeb, V. E., Sinogeykin, A. G., Vlasov, I. I. Heat release by isolated mouse brain mitochondria detected with diamond thermometer. Nanomaterials, 13(1), 98, Jan. 2023, doi: 10.3390/nano13010098.