Анализ электронных спектров поглощения белков и их комплексов является одним из наиболее доступных, универсальных, практически безынерционных и неразрушающих способов исследования их структурно-функциональных свойств. Однако в отличие от атомных линейчатых спектров молекулярные спектры поглощения представляют собой суперпозицию плохо разрешенных перекрывающихся полос, происхождение которых обусловлено квантово-механическими переходами различных по своим свойствам хромофоров. Расщепление системы электронных переходов молекулы до более тонких энергетических состояний вследствие возникновения колебательных и вращательных уровней энергии ядер атомов, в совокупности с неквантуемыми уровнями тепловой энергии и доплеровским уширением, делает такие спектры поглощения практически непрерывными. Кроме этого, в конденсированных средах, в том числе, в водных растворах белков, дополнительно возникают межмолекулярные взаимодействия, приводящие к существенному сглаживанию пиков полос поглощения таким образом, что в итоге наблюдаемый пик может представлять собой суперпозицию, максимум которой не соответствует ни одному из основных электронных переходов в молекуле.

В связи с этим, выявление пиков в плохо разрешенных полосах поглощения представляет собой задачу, которая в той или иной степени может быть решена, как минимизацией межмолекулярного взаимодействия путем изоляции отдельных молекул и уменьшения кинетической энергии системы, так и математически, за счет минимизации постоянной составляющей поглощения в спектре. Наиболее известными решениями стали методы базовой линии, дифференциальной (т.е., разностной) и производной спектрофотометрии. Общий принцип этих методов заключается в уменьшении постоянной составляющей поглощения за счет ее вычитания, что приводит к повышению соотношения значений по оси Oy анализируемого спектра и, как следствие, увеличению разрешения [1-3].

В дополнение к этим методам нами предложен способ, комбинирующий разностную и производную спектрофотометрию. В этом случае в качестве базовой линии (или вычитаемого спектра) выступает аппроксимирующий сплайн от спектра поглощения образца. Вычитанием этого сплайна из спектра поглощения, реализуемого аналогично методу базовой линии или разностной спектрофотометрии, получается функция, которая по своей форме схожа со второй производной спектра поглощения и относительно оси Ox зеркально ее отображает.

В качестве аппроксимирующей функции нами использованы неоднородные рациональные B-сплайны (Non-uniform rational B-spline, NURBS), которые получили широкое распространение в решении задач 2-х и 3-х мерной графики, и в частности, в системах автоматического проектирования. Построение базовой линии к исследуемому спектру поглощения осуществлялось путем варьирования количества контрольных точек (узлов сетки) и порядка сплайна. В качестве демонстрации возможности применения такого решения использовали спектр поглощения раствора гемоглобина, измеренный с шагом 0.2 нм в диапазоне длин волн 240–320 нм (область поглощения хромофоров боковых групп аминокислотных остатков). Этот спектр был «прорежен» (децимирован) с помощью кубического сплайна в спектры с фиксированным шагом интерполяции: 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 и 5.0 нм. Далее эти спектры были аппроксимированы NURBS-кривыми от второго до восьмого порядков, и которые, в дальнейшем, были передискретизированы к исходному значению шага измерения 0.2 нм. Вычитая эти NURBS-кривые из исходного спектра поглощения гемоглобина, получали разностные спектры, по которым можно выявить плохо разрешенные пики полос поглощения. Уменьшение порядка NURBS-кривой и шага интерполяции приводит к росту разрешения пиков поглощения. Однако это разрешение ограничивается отношением сигнал/шум (S/N) в исходном спектре поглощения образца, зависимом от условий измерения спектра. Уже для случая, когда кривая NURBS восьмого порядка получена от децимированного спектра поглощения с шагом 2.0 нм, становится возможным выявить 10 плохо разрешенных пиков полос поглощения без дополнительного подавления шумов этого спектра.

Таким образом, в общем виде, выделение аналитически значимого сигнала в спектрах поглощения достигается минимизацией постоянной составляющей, где NURBS-кривые можно рассматривать как фильтр высоких частот. Следует также отметить, что возможности NURBS-кривых, особенности их применения, а также предлагаемого в настоящей работе метода анализа спектров поглощения полностью не раскрыты и требуют дальнейшего изучения [4-5].



1. Лавриненко И.А., Вашанов Г.А., Рубан М.К. / Анализ вклада хромофоров боковых групп аминокислот в спектр поглощения гемоглобина // Журнал прикладной спектроскопии .– 2013 .– Т. 80(6) .– С. 907-912.

2. Лавриненко И.А., Вашанов Г.А., Артюхов В.Г. / Разложение УФ-спектра поглощения гемоглобина на спектры поглощения простетических групп и апобелка с помощью аддитивной модели // Биофизика .– 2015 .– Т. 60(2) .– С. 253-261.

3. Lavrinenko I.A., Holyavka M.G., Chernov V.E., Artyukhov V.G. / Second derivative analysis of synthesized spectra for resolution and identification of overlapped absorption bands of amino acid residues in proteins: Bromelain and ficin spectra in the 240–320 nm range // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy .– 2020 .– Vol. 227 .– P. 117722. doi: 10.1016/j.saa.2019.117722

4. Лавриненко И.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. / Разрешение перекрывающихся полос поглощения хромофоров белков с помощью неоднородных рациональных базовых сплайнов // Актуальные вопросы биологической физики и химии .– 2017 .– Т. 2(1) .– С. 321-326.

5. Лавриненко И.А., Вашанов Г.А., Артюхов В.Г. / Кривые NURBS в спектральном анализе перекрывающихся полос поглощения некоторых хромофоров белков // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация .– 2018 .– № 4 .– С. 82-88.

Analysis of the electronic absorption spectra of proteins and their complexes is one of the most accessible, universal, practically inertial free, and non-destructive ways to study their structural and functional properties. However, unlike atomic line spectra, molecular absorption spectra are a superposition of poorly resolved overlapping bands whose origin is due to quantum-mechanical transitions of different chromophore properties. The splitting of a molecule's system of electronic transitions to finer energy states due to the appearance of vibrational and rotational energy levels of atomic nuclei, together with the unquantized thermal energy levels and Doppler broadening, makes such absorption spectra virtually continuous. In addition, in condensed media, including aqueous solutions of proteins, intermolecular interactions additionally arise, leading to a significant smoothing of the absorption band peaks in such a way that the observed peak can eventually represent a superposition whose maximum does not correspond to any of the main electronic transitions in the molecule.

In this regard, the identification of peaks in poorly resolved absorption bands is a problem that to some extent can be solved both by minimizing the intermolecular interaction by isolating individual molecules and reducing the kinetic energy of the system, and mathematically, by minimizing the absorption constant component in the spectrum. The best-known solutions were the baseline, differential (i.e., difference), and derivative spectrophotometry methods. The general principle of these methods consists in decreasing the absorption constant component due to its subtraction, which leads to an increase in the ratio of values along the Oy axis of the analyzed spectrum and, therefore, to an increase in the resolution [1-3].

In addition to these methods, we proposed a method combining difference and derivative spectrophotometry. In this case, an approximating spline from the absorption spectrum of the sample acts as a baseline (or a subtracted spectrum). Subtracting this spline from the absorption spectrum implemented similarly to the baseline or difference spectrophotometry method yields a function which is similar in form to the second derivative of the absorption spectrum and mirrors it with respect to the Ox axis.

As an approximating function we used non-uniform rational B-splines (Non-uniform rational B-spline, NURBS), which are widely used in solving problems of 2 and 3-dimensional graphics, and in particular in automatic design systems. Construction of the baseline to the studied absorption spectrum was carried out by varying the number of control points (grid nodes) and the order of the spline. As a demonstration of the possibility of applying this solution, we used the absorption spectrum of hemoglobin solution measured at a step of 0.2 nm in the 240-320 nm wavelength range (the absorption range of chromophores of side groups of amino acid residues). This spectrum was "sliced" (decimated) using a cubic spline into spectra with a fixed interpolation step: 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, and 5.0 nm. These spectra were then approximated by second to eighth order NURBS curves, which were subsequently resampled to an initial measurement step value of 0.2 nm. Subtracting these NURBS curves from the original hemoglobin absorption spectrum yielded difference spectra from which poorly resolved absorption band peaks can be identified. Decreasing the order of the NURBS-curve and the interpolation step leads to an increase in the resolution of the absorption peaks. However, this resolution is limited by the signal-to-noise ratio (S/N) in the original absorption spectrum of the sample, which depends on the spectrum measurement conditions. Already for the case when the eighth order NURBS curve is obtained from the decimated absorption spectrum with a step of 2.0 nm, it becomes possible to identify 10 poorly resolved absorption band peaks without additional suppression of the noise of this spectrum.

Thus, in general form, the separation of analytically significant signal in the absorption spectra is achieved by minimizing the constant component, where the NURBS-curves can be considered as a high-pass filter. It should also be noted that the possibilities of NURBS-curves, the peculiarities of their application, as well as the method of absorption spectra analysis proposed in the present work are not fully disclosed and require further study [4-5].



1. Lavrinenko I.A., Vashanov G.A., Ruban M.K. / Analysis of the Contribution of Chromophores in Side Groups of Amino Acids to the Absorption Spectrum of Hemoglobin // Journal of Applied Spectroscopy .– 2014 .– Vol. 80(6) .– P. 899-204. doi: 10.1007/s10812-014-9862-4

2. Lavrinenko I.A., Vashanov G.A., Artyukhov V.G. / Decomposition of the hemoglobin UV absorption spectrum into the absorption spectra of a prosthetic group and apoprotein using an additive model // Biophysics .– 2015 .– Vol. 60(2) .– P. 197-204. doi: 10.1134/S0006350915020098

3. Lavrinenko I.A., Holyavka M.G., Chernov V.E., Artyukhov V.G. / Second derivative analysis of synthesized spectra for resolution and identification of overlapped absorption bands of amino acid residues in proteins: Bromelain and ficin spectra in the 240–320 nm range // Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy .– 2020 .– Vol. 227 .– P. 117722. doi: 10.1016/j.saa.2019.117722

4. Lavrinenko I.A., Holyavka M.G., Artyukhov V.G. / Resolution of the Overlapping Beams of Proteins Chromophores Absorption by Non-Uniform Rational Basis Splinees // Russian Journal of Biological Physics and Chemisrty .– 2017 .– Vol. 2(1) .– P. 321-326. [In Russian]

5. Lavrinenko I.A., Vashanov G.A., Artyukhov V.G. / NURBS in the Spectral Analysis of the Overlapping Beams of Absorption оf Some Protein Chromophores // Proceedings of Voronezh State University. Series: Chemistry. Biology. Pharmacy .– 2014 .– No. 4 .– P. 82-88. [In Russian]