За последнее десятилетие методы лечения, стимулирующие противоопухолевый иммунный ответ, в частности, чек-поинт иммунотерапия, произвели революцию в лечении рака. Несмотря на это, далеко не у всех пациентов наблюдается выраженный ответ на лечение, и лишь в меньшей части случаев достигается максимальный клинический эффект. Для улучшения иммунотерапии рака необходимы надежные маркеры для предсказания эффективности лечения. Перспективной стратегией может быть оценка метаболического статуса лимфоцитов, отражающая ключевые изменения в иммунных клетках в ответ на опухоль и терапию. Инновационной технологией для оценки метаболизма клеток является время-разрешенный флуоресцентный имиджинг (FLIM) метаболических коферментов. В отличие от стандартных методов, FLIM не требует использования красителей, деструкции тканей и позволяет получать изображения в режиме реального времени. Однако работы по метаболическому FLIM-имиджингу иммунных клеток пока единичны.

Исследование проводились на мышах линии C57Bl/6 FoxP3-EGFP с меланомой B16F0, привитой вблизи пахового лимфатического узла (ЛУ). Мышам вводили антитела к CTLA-4 (Bio X Cell, США) (250 мкг на мышь, внутрибрюшинно на 7, 8, 11 и 12 дни роста опухоли). FLIM-изображения в канале кофермента никотинамидадениндинуклеотида (фосфата) (НАД(Ф)Н) (возбуждение 375 нм, прием 435–485 нм) получали с помощью флуоресцентного конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 880 (Carl Zeiss, Германия), оснащенного модулем FLIM Simple Tau 152 TCSPC (Becker & Hickl GmbH, Германия). Проточную цитометрию проводили с использованием клеточного сортера BD FACSAria III.

Впервые разработан протокол исследования автофлуоресценции иммунных клеток из свежих фрагментов ЛУ. Параметры времени жизни флуоресценции кофермента НАД(Ф)Н демонстрируют чувствительность к развитию опухоли. Наиболее выраженными изменениями в процессе роста опухоли были увеличение относительной амплитуды свободного НАДН α1 и увеличение вклада фосфорилированной формы НАДФН α3. Вероятной причиной роста α1 и α3 может быть, соответственно, сдвиг в сторону гликолиза и усиление пентозофосфатного пути для обеспечения повышенных потребностей антиген-активированных Т-клеток. Данные проточной цитометрии подтверждают повышение экспрессии поверхностных маркеров активации CD25 и CD69 и продукции интерферона-гамма (IFNγ), а также увеличение индекса пролиферации Ki67 в субпопуляциях эффекторных CD4+Th и CD8+ T-клеток.

Касательно анти-CTLA-4-терапии, у мышей, отвечающих на терапию (с замедленным ростом опухоли) наблюдалось увеличение относительной амплитуды свободного НАДН α1, ассоциированного с гликолизом, по сравнению с мышами с прогрессирующей опухолью, а также с нелеченными контрольными мышами. В то же время у мышей, не отвечающих на терапию, наблюдалось выраженное снижение α1 даже по сравнению с контрольной группой без лечения. Данные FLIM коррелируют с уровнем экспрессии активационных (CD25, CD69 и IFNγ) и пролиферативных (Ki67) маркеров.

Таким образом, FLIM-микроскопия автофлуоресценции кофермента НАД(Ф)Н в иммунных клетках может служить мощным инструментом для оценки иммунного ответа на опухоль и прогнозирования эффективности иммунотерапии.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (№ 21-74-00101).

Over the past decade, therapies that promote antitumor immune responses have revolutionized the treatment of cancer, resulting in marked and durable responses in subsets of patients across many different tumor types. Despite this, only a subset of patients responds to the therapy, and smaller portions achieve maximum clinical benefit. Reliable markers for the treatment efficiency is required for improvement of cancer immunotherapy. The promising strategy can be the evaluation of the metabolic status of the lymphocytes that reflects the key changes in response to tumor and therapy. An innovative technology for the metabolic assessment is fluorescent lifetime imaging (FLIM) of metabolic coenzymes. Unlike standard methods, FLIM does not require the cell staining, tissue destruction, and allows real-time imaging. However, studies on metabolic FLIM imaging of immune cells are still rare.

The studies were carried out on C57Bl/6 FoxP3-EGFP mice with subcutaneous B16F0 melanoma implanted near the inguinal lymphatic node (LN). The mice were treated with anti-CTLA-4 antibodies (Bio X Cell, USA) (250 μg per mouse, intraperitoneal injection at 7, 8, 11 and 12 days of tumor growth). Nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) (NAD(P)H) fluorescence lifetime images were acquired using an LSM 880 (Carl Zeiss, Germany) fluorescence confocal laser-scanning microscope equipped with an FLIM module Simple Tau 152 TCSPC (Becker & Hickl GmbH, Germany) (ex. 375 nm, em. 435–485 nm). The flow cytometry was performed using a FACSAria III cell sorter.

For the first time, a protocol for studying the autofluorescence of immune cells from fresh LN fragments has been developed. NAD(P)H lifetime parameters show sensitivity to tumor development. The most pronounced changes during tumor growth were an increase in the relative amplitude of free NADH α1 and an increase in the contribution of the phosphorylated form of NADPH α3. A likely reason for the increase in α1 and α3 may be, respectively, a shift towards glycolysis and an increase in the pentose phosphate pathway to provide the increased demand of antigen-activated T cells. Flow cytometry data confirmed an increase in the expression of surface activation markers CD25 and CD69 and production of interferon-gamma (IFNγ), as well as an increase in the proliferation index Ki67 in CD4+Th and CD8+ T cell subpopulations.

Concerning the anti-CTLA-4 therapy, mice with tumor growth inhibition (responders) showed an increase in the relative amplitude of glycolysis-associated free NADH α1 compared to advanced tumor mice as well as untreated control mice with similar tumor size. At the same time, non-responder mice show a pronounced decrease in α1 even compared to the control group. FLIM data correlate with the level of expression of activation (CD25, CD69 and IFNγ) and proliferative (Ki67) markers.

Therefore, FLIM microscopy of NAD(P)H coenzyme autofluorescence in immune cells can be a powerful tool for assessing the immune response to a tumor and predicting the effectiveness of immunotherapy.

This work was supported by Russian Science Foundation (# 21-74-00101).