Одним из перспективных направлений современной молекулярной биофизики является исследование иммобилизованных биологических систем – ферментов и их комплексов. Общепризнано, что при промышленном масштабировании каталитических процессов гетерогенный режим их проведения (биосистема находится в иммобилизованном на нерастворимом носителе состоянии) является экономически более выгодным по сравнению с гомогенными технологиями (биообъекты равномерно распределены в фазе растворителя), так как при этом значительно упрощается и удешевляется весь производственный цикл.

Дополнение экспериментальных эмпирических подходов по подбору удачных комбинаций фермент-носитель в условиях различного микроокружения современными методами компьютерного и математического моделирования позволяет не только экономить материальные ресурсы на апробацию иммобилизационных агентов и выявлять механизмы процесса иммобилизации, но и создавать принципиально новые комплексы препаратов на основе использования направленного конструирования материалов (лигандов, подложек, сшивок) [1]. Для получения иммобилизованного биообъекта, востребованного на современном рынке, исследователь должен хорошо разбираться не только в области классической биофизики, но и в вопросах моделирования и анализа структурно-функциональных особенностей широкого круга молекул, уметь выявлять фундаментальные механизмы, управляющие конформационными перестройками в биополимерах, определять наиболее вероятные пути образования комплексов различной природы и протекания химических реакций. Для этого необходимо уметь активно манипулировать теоретическими подходами – современными методами квантовой химии: методами молекулярной динамики в полноатомном приближении, гибкого молекулярного докинга, методами прогнозирования спектров биологической активности и высокопроизводительным виртуальным скринингом соединений.

К настоящему времени нашим исследовательским коллективом раскрыты особенности физико-химических, кинетических и структурно-функциональных свойств инулиназ и некоторых цистеиновых протеаз (бромелина, папаина, фицина) в условиях различного микроокружения с точки зрения фундаментальной и прикладной науки [2]. В сравнительном аспекте описаны методы регулирования активности названных гидролаз, дана характеристика гетерогенных препаратов на основе иммобилизованных энзимов и предложены пути их применения [3, 4].

Проанализированы физико-химические и кинетические свойства гетерогенных биокатализаторов. Особое внимание было уделено описанию функциональных свойств ферментов в условиях различного микроокружения, выявлению оптимальных для их функционирования параметров системы, характеристике стабильности белковых макромолекул, устойчивости их к температурным воздействиям и экстремальным значениям рН среды [5].

Показано, что одним из эффективных путей регулирования и стабилизации активности изучаемых нами гидролаз является их иммобилизация. Выдвинуто предположение о том, что механизмы стабилизации иммобилизованного фермента в условиях экстремальных значений pH, температуры, а также других денатурирующих агентов в главных чертах совпадают и обусловлены, прежде всего, изменением степени мобильности третичной структуры белка, ответственной за образование фермент-субстратного комплекса. Установлено, что универсального метода иммобилизации гидролитических ферментов в настоящее время не существует, каждый из способов имеет свои преимущества и недостатки [6]. В целом выбор метода иммобилизации биокатализатора зависит от задач исследования и направления использования получаемого препарата в той или иной области науки и производства. Обсуждаемые нами научные положения будут обоснованы демонстрацией необходимого иллюстративного материала.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №21-74-20053)

1. Holyavka M.G., Artyukhov V.G., Kondratyev M.S., Samchenko A.A., Kabanov A.V., Komarov V.M. / In silico design of high-affinity ligands for the immobilization of inulinase // Computers in Biology and Medicine. – 2016. – V. 71. – P. 198-204.

2. Аpтюxов В.Г., Ковалева Т.А., Xолявка М.Г., Битюцкая Л.А., Гpечкина М.В., Обpазцова Т.Б. / Иccледование олигомеpной cтpуктуpы и некотоpыx физико-xимичеcкиx cвойcтв инулиназы из Kluyveromyces marxianus Y-303 / Биофизика. – 2009. – Т. 54. – № 6. – С. 1005-1011.

3. Kholyavka M.G., Kayumov A.R., Baydamshina D.R., Koroleva V.A., Trizna E.Yu., Trushin M.V. / Efficient fructose production from plant extracts by immobilized inulinases from Kluyveromyces marxianus and Helianthus tuberosus // International Journal of Biological Macromolecules. – 2018. – V. 115. – P. 829-834.

4. Baidamshina D.R., Trizna E.Y., Agafonova M.N., Chirkova M.N., Vasileva O.S., Akhmetov N., Shubina V.V., Porfiryev A.G., Semenova E.V., Sachenkov O.A., Baltina T.V., Kayumov A.R., Koroleva V.A., Pankova S.M., Artyukhov V.G., Holyavka M.G., Bogachev M.I. / Anti-biofilm and wound-healing activity of chitosan-immobilized ficin // International Journal of Biological Macromolecules. – 2020. – V. 164. – P. 4205-4217.

5. Холявка М.Г., Ковалёва Т.А., Хрупина Е.А., Волкова С.А., Артюхов В.Г. / Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus / Биотехнология. – 2012. – № 6. – С. 31-42.

6. Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. / Характеристика инулиназ. Пути регулирования и стабилизации их активности // Биотехнология. – 2012. – № 1. – С. 43-63.

One of the promising areas of modern molecular biophysics is the study of immobilized biological systems – enzymes and their complexes. It is generally recognized that in the industrial scale-up of catalytic processes, the heterogeneous mode of their implementation (the biosystem is in a state immobilized on an insoluble carrier) is more economically advantageous compared to homogeneous technologies (biological objects are evenly distributed in the solvent phase), since this greatly simplifies and reduces the cost of the entire production production cycle.

The addition of experimental empirical approaches to the selection of successful enzyme-carrier combinations in various microenvironments with modern methods of computer and mathematical modeling allows not only saving material resources for testing immobilization agents and revealing the mechanisms of the immobilization process, but also creating fundamentally new complexes based on the use of directed materials design (ligands, substrates, crosslinks) [1]. To obtain an immobilized biological object that is in demand on the modern market, a researcher should be well versed not only in the field of classical biophysics, but also in modeling and analyzing the structural and functional features of a wide range of molecules, be able to identify the fundamental mechanisms that control conformational rearrangements in biopolymers, determine the most probable ways of various nature complexes formation and the course of chemical reactions. To do this, it is necessary to be able to actively manipulate theoretical approaches – modern methods of quantum chemistry: methods of molecular dynamics in the full-atom approximation, flexible molecular docking, methods for predicting the spectra of biological activity and high-performance virtual screening of compounds.

To date, our research team has revealed the features of the physicochemical, kinetic, structural and functional properties of inulinases and some cysteine proteases (bromelain, papain, ficin) under conditions of various microenvironments from the point of view of fundamental and applied science [2]. In a comparative aspect, methods for regulating the activity of these hydrolases are described, heterogeneous preparations based on immobilized enzymes are characterized, and ways of their application are proposed [3, 4].

The physicochemical and kinetic properties of heterogeneous biocatalysts are analyzed. Particular attention was paid to describing the functional properties of enzymes under different microenvironment conditions, identifying optimal system parameters for their functioning, characterizing the stability of protein macromolecules, their resistance to temperature effects and extreme pH values [5].

It has been shown that one of the effective ways to regulate and stabilize the activity of hydrolases studied by us is their immobilization. It has been suggested that the mechanisms of the immobilized enzyme stabilization under conditions of extreme pH values, temperature, and other denaturing agents largely coincide and are primarily due to a change in the degree of the protein tertiary structure mobility responsible for the formation of the enzyme-substrate complex. It has been established that there is currently no universal method for the immobilization of hydrolytic enzymes; each of the methods has its own advantages and disadvantages [6]. In general, the choice of a biocatalyst immobilization method depends on the objectives of the study and the direction of the resulting preparation use in a particular area of science and production. The scientific positions we are discussing will be substantiated by the demonstration of the necessary illustrative material.

The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project No. 21-74-20053)

1. Holyavka M.G., Artyukhov V.G., Kondratyev M.S., Samchenko A.A., Kabanov A.V., Komarov V.M. / In silico design of high-affinity ligands for the immobilization of inulinase // Computers in Biology and Medicine. – 2016. – V. 71. – P. 198-204.

2. Artyukhov V.G., Kovaleva T.A., Kholyavka M.G., Bityutskaya L.A., Grechkina M.V., Obraztsova T.B. / Study of the oligomeric structure and some physicochemical properties of inulinase from Kluyveromyces marxianus Y-303 // Biophysics. – 2009. – V. 54. – № 6. – P. 675-680.

3. Kholyavka M.G., Kayumov A.R., Baydamshina D.R., Koroleva V.A., Trizna E.Yu., Trushin M.V. / Efficient fructose production from plant extracts by immobilized inulinases from Kluyveromyces marxianus and Helianthus tuberosus // International Journal of Biological Macromolecules. – 2018. – V. 115. – P. 829-834.

4. Baidamshina D.R., Trizna E.Y., Agafonova M.N., Chirkova M.N., Vasileva O.S., Akhmetov N., Shubina V.V., Porfiryev A.G., Semenova E.V., Sachenkov O.A., Baltina T.V., Kayumov A.R., Koroleva V.A., Pankova S.M., Artyukhov V.G., Holyavka M.G., Bogachev M.I. / Anti-biofilm and wound-healing activity of chitosan-immobilized ficin // International Journal of Biological Macromolecules. – 2020. – V. 164. – P. 4205-4217.

5. Kholyavka M.G., Kovaleva T.A., Khrupina E.A., Volkova S.A., Artyukhov V.G. / Design of a heterogeneous enzymatic preparation on the basis of immobilized inulinase from Helianthus tuberosus // Biotechnology in Russia. – 2012. – № 6. – P. 31-41.

6. Kovaleva T.A., Kholyavka M.G., Artyukhov V.G. / Characteristics of inulinases: methods for regulation and stabilization of their activity // Biotechnology in Russia. – 2012. – № 1. – P. 43-63.