Применяемый для лечения инвазивных грибковых заболеваний полиеновый антибиотик «Амфотерицин B» [2] может использоваться в качестве флуоресцентного зонда, благодаря своей способности связываться с холестерином, в том числе в составе мембран, и формировать с ним флуорогенные комплексы [1]. Механизмы взаимодействий данного антибиотика с биологическими мембранами сложны и подлежат дальнейшим исследованиям.

В связи с вышеизложенным целью данной работы явилось исследование влияния амфотерицина В на цитоархитектонику эритроцитов крови человека. Эритроцитарные клетки из крови доноров получали по стандартной методике [3]. Полученная суспензия эритроцитов была доведена до концентрации 106 кл./мл. Затем к 4 мл эритроцитарной суспензии добавляли 1 мл амфотерицина B в концентрациях 2,5 • 10-5 и 5,4 • 10-5 М.

Поверхностную архитектонику эритроцитов крови доноров изучали на сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM 6380-LV (Япония) при ускоряющем напряжении 20 кВ на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием Воронежского государственного университета (URL: http://ckp.vsu.ru). Для детального анализа характера изменений поверхностной архитектоники эритроцитов рассчитывали следующие показатели (в %): количество дискоцитов (Д); количество обратимо деформированных эритроцитов (ОД); количество необратимо деформированных эритроцитов (НД); индекс трансформации (ИТ), представляющий собой соотношение количества патологических и нормальных форм эритроцитов; индекс обратимой трансформации (ИОТ) – соотношение обратимо деформированных и нормальных форм эритроцитов; индекс необратимой трансформации (ИНОТ) – соотношение необратимо деформированных и нормальных форм эритроцитов [4].

Контрольный образец суспензии содержал 93,9 % дискоцитов, 4,2 % ОД клеток и 2,0 % НД эритроцитов. Показатели индексов трансформации имели следующие значения: ИТ = 0,066±0,004 %; ИОТ = 0,045±0,003 %; ИНОТ = 0,021±0,002 %. Данные параметры цитоархитектоники соответствуют морфологическому профилю эритроцитарных клеток здорового человека и согласуются с результатами исследований, проведенных ранее на кафедре биофизики и биотехнологии ВГУ [4, 5]. После инкубации эритроцитарных клеток с амфотерицином B в концентрациях 2,5 • 10-5 и 5,4 • 10-5 М в течение 15 минут наблюдалось снижение уровня дискоцитов до 3,6 и 6,2 % соответственно, при этом было отмечено повышение ОД до 11,4 и 8,6 %; НД до 20,4 и 26,8 %; ИТ до 11,0 и 7,4 %; ИОТ до 3,7 и 1,4 % и ИНОТ до 7,3 и 6,0 % по сравнению с интактными образцами. Также в исследуемых образцах после инкубации с антибиотиком наблюдалось значительное увеличение количества сфероцитов, эхиноцитов, эритроцитов в виде «тутовой ягоды» и клеток с одним и с множественными выростами.

Таким образом, воздействие амфотерицина В на суспензии эритроцитов способствовало повышению числа обратимо и необратимо деформированных клеток в образцах. Среди выявленных форм эритроцитов наблюдалось увеличение количества клеток с одним и с множественными выростами, а также сфероцитов, эхиноцитов и эритроцитов в виде «тутовой ягоды», что свидетельствует о нарушении эластичности эритроцитарной мембраны вследствие экстракции холестерина из нее.



Библиографические ссылки



1. Amphotericin B as a Cholesterol Identifier in Human Erythrocyte's Membrane / Kalaeva E.A., Sokolova L.O., Artyukhov V.G., Nakvasina M.A., Putintseva O.V. // Opera Medica et Physioligia. — 2022. — Vol. 9. —№ 1. — P. 42-48.

2. The in-vitro study of novel phospholipid micelles loaded with amphotericin B on plasmodium falciparum protozoan / Rajablou K., Attar H., Sadjady S. K., Heydarinasab A. // Chemistry and Physics of Lipids. — 2022. — Vol. 245. — P.1-7.

3. Артюхов В.Г. Практикум по биофизике / В.Г. Артюхов [и др.] — Воронеж: Изд-во ВГУ, 2016. — 294 с.

4. Влияние коротковолнового УФ-света (254 нм) на цитоархитектонику и спектральные характеристики эритроцитов крови доноров / Соколова Л.О., Путинцева О.В., Артюхов В.Г. // Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2021: материалы XVI международной научной конференции, 13-17 сентября 2021 г. — Севастополь. — С.169-170.

5. Применение метода сканирующей электронной микроскопии в клинико-лабораторной диагностике деформации мембран эритроцитов крови человека / Соколова Л.О., Корвякова П.В., Автаев Д.В., Путинцева О.В., Артюхов В.Г. // Тезисы докладов 74-й Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых, посвященной памяти проф. А.П. Веселова, 20–23 апреля 2021 г. — Н. Новгород, Университет Лобачевского. — С. 205-206.

The polyene antibiotic Amphotericin B used for the treatment of invasive fungal diseases [2] can be used as a fluorescent probe due to its ability to bind to cholesterol, including in membranes, and form fluorogenic complexes with it [1]. The mechanisms of interaction of this antibiotic with biological membranes are complex and are subject to further studies.

In view of the above, the aim of this work was to study the effect of amphotericin B on the cytoarchitectonics of human blood erythrocytes. Erythrocyte cells from donor blood were obtained according to the standard technique [3]. The obtained erythrocyte suspension was brought to a concentration of 106 kl/mL. Then, 1 ml of amphotericin B was added to 4 ml of erythrocyte suspension at the concentrations of 2.5 - 10-5 and 5.4 - 10-5 M.

The surface architectonics of donor erythrocytes was studied using a scanning electron microscope JEOL JSM 6380-LV (Japan) at an accelerating voltage of 20 kV at the Center for Collective Use of Scientific Equipment of Voronezh State University (URL: http://ckp.vsu.ru). For a detailed analysis of the character of changes in the surface architectonics of erythrocytes the following parameters were calculated (in %): number of discocytes (D); number of reversibly deformed erythrocytes (OD); number of irreversibly deformed erythrocytes (ID); transformation index (IT), which is the ratio of the number of pathological and normal forms of erythrocytes; reversible transformation index (RTI) - the ratio of reversibly deformed and normal forms of erythrocytes; irreversible transformation index (INOT) - the ratio of irreversibly deformed and normal forms of erythrocytes [4].

The control suspension sample contained 93.9 % of discocytes, 4.2 % of OD cells, and 2.0 % of ND erythrocytes. The indexes of transformation had the following values: IT = 0.066±0.004 %; IOT = 0.045±0.003 %; INOT = 0.021±0.002 %. These parameters of cytoarchitectonics correspond to the morphological profile of healthy human erythrocyte cells and agree with the results of studies conducted earlier at the Department of Biophysics and Biotechnology of the VSU [4, 5]. After incubation of erythrocyte cells with amphotericin B at concentrations of 2.5 - 10-5 and 5.4 - 10-5 M for 15 min, the level of discocytes decreased to 3.6 and 6.2 % respectively, while the increase of OD to 11.4 and 8.6 % was observed; ND to 20.4 and 26.8 %; IT to 11.0 and 7.4 %; IOT to 3.7 and 1.4 % and INOT to 7.3 and 6.0 % compared to intact samples. Also, a significant increase in the number of spherocytes, echinocytes, erythrocytes in the form of "mulberry" and cells with one and with multiple growths was observed in the samples tested after incubation with the antibiotic.

Thus, exposure of erythrocyte suspensions to amphotericin B contributed to an increase in the number of reversibly and irreversibly deformed cells in the samples. Among the forms of erythrocytes detected, there was an increase in the number of cells with one and with multiple growths, as well as spherocytes, echinocytes and erythrocytes in the form of "mulberry", which indicates a violation of elasticity of the erythrocyte membrane due to cholesterol extraction from it.



Bibliographic references



1. Amphotericin B as a Cholesterol Identifier in Human Erythrocyte's Membrane / Kalaeva E.A., Sokolova L.O., Artyukhov V.G., Nakvasina M.A., Putintseva O.V. // Opera Medica et Physioligia. - 2022. - Vol. 9. -№ 1. - P. 42-48.

2. The in-vitro study of novel phospholipid micelles loaded with amphotericin B on plasmodium falciparum protozoan / Rajablou K., Attar H., Sadjady S.. K., Heydarinasab A. // Chemistry and Physics of Lipids. - 2022. - Vol. 245. - P.1-7.

3. Artyukhov V.G. Practical training on biophysics / V.G. Artyukhov [et al.] - Voronezh: Publishing house of VSU, 2016. - 294 с.

4. Effect of short-wave UV light (254 nm) on cytoarchitectonics and spectral characteristics of donor blood erythrocytes / Sokolova L.O., Putintseva O.V., Artyukhov V.G. // Actual issues of biological physics and chemistry. BPC-2021: Proceedings of the XVI International Scientific Conference, September 13-17, 2021 - Sevastopol. - С.169-170.

5. Sokolova L.O., Korvyakova P.V., Avtaev D.V., Putintseva O.V., Arthukhov V.G. // Theses of reports of 74-th All-Russian School-Conference of Young Scientists with international participation in memory of Professor A.P. Veselov, 20-23 April 2021 - Novgorod, Lobachevsky University. - С. 205-206.