Исследование механизма взаимодействия биомакромолекул с различными элементами микроокружения может значительно расширить представления о функционировании биополимеров, а также предсказать пути модуляции их биологической активности. Перспективными компонентами для создания ферментных препаратов для биомедицины и биотехнологии являются природные полисахариды – материалы, сочетающие в себе доступность, низкую стоимость, нетоксичность, неиммуногенность и биосовместимость. В связи с этим целью настоящей работы является исследование механизма взаимодействия цистеиновой протеазы фицина (КФ 3.4.22.3) и N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозана (ГПХ) – производного хитозана, проявляющего поликатионные свойства в широком диапазоне значений рН среды.

Конъюгаты фицина с ГПХ с молекулярными массами 200, 350 и 600 кДа получали комплексообразованием в боратном буфере с рН 9. Механизм взаимодействия исследовали методами гибкого молекулярного докинга и ИК-спектроскопии. Содержание белка в полученных конъюгатах определяли модифицированным методом Лоури, протеолитическую активность оценивали по скорости реакции гидролиза субстрата – азоказеина [1-4].

Из расчетов молекулярного докинга установлено, что взаимодействие фицина с ГПХ протекает самопроизвольно, при этом последний располагается в щели между двумя доменами глобулы фицина, содержащей активный центр фермента. Между белком и лигандом образуется четыре водородных связи, включая одну, сформированную каталитически значимым остатком – Gln19. Остаток Cys25, непосредственно входящий в состав активного центра фермента, вступает в гидрофобные взаимодействия с гидроксипропильными фрагментами. Со стороны лиганда водородные связи образуются преимущественно за счет пиранозных циклов, исключение – Lys145, взаимодействующий с ОН-группой бокового фрагмента.

Результаты ИК-спектроскопии коррелируют с данными, полученными путем in silico исследования, и подтверждают те же функциональные группы и фрагменты макромолекул носителя, участвующие во взаимодействии с фицином. По положению полосы Амид I фицина в ИК-спектре конъюгата можно сделать предположение об изменениях во вторичной структуре энзима: конформация от глобулярной переходит к более вытянутой и обогащенной β-структурами.

В результате исследования каталитической способности полученных нами образцов, установлено, что общая протеолитическая активность (в ед/мл раствора) для нативного фицина и фермента, конъюгированного на носителе с молекулярными массами 200, 350 и 600 кДа, составляет 96±4 и 106±4, 108±5, 99±3 соответственно. Эти величины довольно близки и в целом несколько выше для конъюгированного фицина. Значения же удельной активности (в ед/мг белка) конъюгированных препаратов существенно превышают эту величину для свободного фицина и составляют соответственно 948±3, 1037±10, 1591±12 и 787±4 для нативного энзима и фермента, конъюгированного на носителе с молекулярными массами 200, 350 и 600 кДа. Таким образом, можно говорить о явлении гиперактивации фицина, обусловленной конформационными изменениями глобулы фермента.

Из представленных данных вытекает, что наивысшие значения активности наблюдается для препаратов, полученных с использованием ГПХ с молекулярной массой 350 кДа, наименьшие – для носителя с молекулярной массой 600 кДа. Для интерпретации этого феномена было проведено морфологическое исследование поверхности носителя. В результате этого было обнаружено, что в отличие от носителей с молекулярной массой 200 и 600 кДа N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозан с молекулярной массой 350 кДа имеет ячеистую структуру с размерами пор порядка 80 нм. По-видимому, при конъюгировании фицин, размер глобул которого составляет порядка 5 нм, располагается в порах носителя, и это способствует увеличению активности фермента.

Таким образом, показано, что совокупное влияние модуляции активного центра фицина и морфологии поверхности N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозана с молекулярной массой 350 кДа приводит к увеличению протеолитической активности фицина.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ, проект № 21-74-20053

Литература

1. Sorokin A.V., Olshannikova S.S., Malykhina N.V. et al. Acyl-Modified Water-Soluble Chitosan Derivatives as Carriers for Adsorption Immobilization of Papain. Russ J Bioorg Chem 48, 310–320 (2022).

2. Olshannikova S.S., Malykhina N.V., Lavlinskaya M.S. et al. Novel Immobilized Biocatalysts Based on Cysteine Proteases Bound to 2-(4-Acetamido-2-sulfanilamide) Chitosan and Research on Their Structural Features. Polymers, 14, 3223 (2022)

3. Sorokin A.V., Olshannikova S.S.; Lavlinskaya M.S. et al. Chitosan Graft Copolymers with N-Vinylimidazole as Promising Matrices for Immobilization of Bromelain, Ficin, and Papain. Polymers, 14, 2279 (2022).

4. Ol’shannikova S.S., Red’ko Y.A., Lavlinskaya M.S. et al. Preparation of Papain Complexes with Chitosan Microparticles and Evaluation of Their Stability Using the Enzyme Activity Level. Pharm Chem J 55, 1240–1244 (2022).

The study of the mechanism of biomacromolecules interaction with various elements of the microenvironment can significantly expand the understanding of the biopolymers functioning, as well as predict the ways of modulating their biological activity. Promising components for the creation of enzyme preparations for biomedicine and biotechnology are natural polysaccharides, materials that combine availability, low cost, non-toxicity, non-immunogenicity and biocompatibility. In this regard, the aim of this work is to study the mechanism of interaction between the cysteine protease ficin (EC 3.4.22.3) and N-(2-hydroxy)propyl-3-trimethylammonium chitosan (HPTAC), a chitosan derivative exhibiting polycationic properties in a wide range of pH values. .

Conjugates of ficin and HPTAC with molecular weights of 200, 350, and 600 kDa were obtained by complexation in borate buffer with pH 9. The interaction mechanism was studied by flexible molecular docking and FTIR. The protein content in the resulting conjugates was determined by the modified Lowry method, and the proteolytic activity was assessed by the rate of the hydrolysis reaction of the azocasein substrate [1-4].

Based on molecular docking, it was found that the interaction of ficin with HPTAC proceeds spontaneously, with the latter being located in the gap between two domains of the ficin globule containing the active center of the enzyme. Four hydrogen bonds are formed between the protein and the ligand, including one formed by a catalytically significant Gln19 residue. The Cys25 residue, which is directly part of the active site of the enzyme, enters into hydrophobic interactions with hydroxypropyl fragments. On the ligand side, hydrogen bonds are formed mainly due to pyranose cycles, with the exception of Lys145, which interacts with the OH-group of the side fragment.

The results of FTIR correlate with the data obtained by in silico studies and confirm the same functional groups and fragments of carrier macromolecules involved in the interaction with ficin. Based on the position of the Amide I band of ficin in the FTIR spectrum of the conjugates, one can make an assumption about changes in the secondary structure of the enzyme: the conformation changes from globular to more elongated and enriched in β-structures.

As a result of the study of the catalytic ability of the samples obtained by us, it was found that the total proteolytic activity (in U/ml of solution) for native ficin and the enzyme conjugated on a carrier with molecular weights of 200, 350 and 600 kDa is 96 ± 4 and 106 ± 4, 108±5, 99±3, respectively. These values are quite close and, in general, somewhat higher for conjugated ficin. The specific activity values (in units/mg of protein) of the conjugated preparations significantly exceed this value for free ficin and are 948±3, 1037±10, 1591±12, and 787±4, respectively, for the native enzyme and the enzyme conjugated on a carrier with molecular weights 200, 350 and 600 kDa. Thus, phenomenon of ficin hyperactivation is occurred, mainly due to conformational changes in the enzyme globule.

From the presented data, it follows that the highest activity values are observed for preparations obtained using HPTAC with a molecular weight of 350 kDa, and the lowest values are observed for a carrier with a molecular weight of 600 kDa. To interpret this phenomenon, a morphological study of the carrier surface was carried out. As a result, it was found that, in contrast to supports with a molecular weight of 200 and 600 kDa, N-(2-hydroxy)propyl-3-trimethylammonium chitosan with a molecular weight of 350 kDa has a porous structure with a cavity size of about 80 nm. Apparently, during conjugation, ficin, whose globule size is about 5 nm, is located in the pores of the carrier, and this contributes to an increase in the activity of the enzyme.

Thus, it has been shown that the combined effect of modulation of the active site of ficin and the surface morphology of N-(2-hydroxy)propyl-3-trimethylammonium chitosan with a molecular weight of 350 kDa leads to an increase in the proteolytic activity of ficin.

The work was supported by the Russian Science Foundation, project No. 21-74-20053.

Reference

1. Sorokin A.V., Olshannikova S.S., Malykhina N.V. et al. Acyl-Modified Water-Soluble Chitosan Derivatives as Carriers for Adsorption Immobilization of Papain. Russ J Bioorg Chem 48, 310–320 (2022).

2. Olshannikova S.S., Malykhina N.V., Lavlinskaya M.S. et al. Novel Immobilized Biocatalysts Based on Cysteine Proteases Bound to 2-(4-Acetamido-2-sulfanilamide) Chitosan and Research on Their Structural Features. Polymers, 14, 3223 (2022)

3. Sorokin A.V., Olshannikova S.S.; Lavlinskaya M.S. et al. Chitosan Graft Copolymers with N-Vinylimidazole as Promising Matrices for Immobilization of Bromelain, Ficin, and Papain. Polymers, 14, 2279 (2022)

4. Ol’shannikova S.S., Red’ko Y.A., Lavlinskaya M.S. et al. Preparation of Papain Complexes with Chitosan Microparticles and Evaluation of Their Stability Using the Enzyme Activity Level. Pharm Chem J 55, 1240–1244 (2022).