Болезнь Альцгеймера — разрушительное нейродегенеративное заболевание, приводящее к тяжелой деменции. Детальная информация о структуре, динамике и межмолекулярных взаимодействиях биомолекул, непосредственно участвующих в развитии болезни Альцгеймера, необходима для рациональной разработки новых биологически активных соединений и скрининга существующих с целью получения наиболее эффективных кандидатов в лекарственные средства [1]. Генетические данные убедительно свидетельствуют о том, что аберрантное образование, агрегация и/или клиренс нейротоксических пептидов амилоида-β (Aβ) запускает заболевание. Aβ аккумулируется в местах контакта нейронов в упорядоченные тяжи и фибриллы, образуя так называемые сенильные бляшки. При этом изоформы Aβ различной длины обнаруживаются в мозгу здоровых людей независимо от возраста и, по-видимому, играют роль в сигнальных путях в головном мозге и обладают нейропротекторными свойствами при низких концентрациях. Изоформы Aβ являются продуктом последовательного расщепления мембранного белка-предшественника амилоида (APP).

D-энантиомерный пептид D3 и его производные недавно были отобраны с помощью фагового дисплея для прямого разрушения агрегатов цитотоксического Aβ [2]. В настоящее время одно из D3-подобных соединений должно пройти фазу II клинических испытаний, однако молекулярные детали его профилактического или фармакологического действия с высоким разрешением не совсем ясны. Для решения проблемы мы использовали комплексный подход, основанный на биохимических и биофизических методах, таких как белковая инженерия, микроскопический термофорез, флуоресцентная конфокальная микроскопия, флуоресцентная поляризация, калибровка микрофлюидной диффузии, круговой дихроизм, спектроскопия ядерного магнитного резонанса высокого разрешения (ЯМР) и компьютерное моделирование. В работе мы представляем экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что D3-пептид, будучи внутренне неупорядоченным пептидом (IDP), может динамически и специфически связываться IDP/IDP-подобным образом с внеклеточной частью мембраносвязанного Aβ-предшественника, трансмембранным CTFβ фрагментом белка-предшественника амилоида (APP672-726, Aβ1-55 в нумерации β-амилоида). Гетероядерная ЯМР-спектроскопия показала, что D3-пептид напрямую связывается с амфифильной примембранным JM-участком Aβ17-26, который в зависимости от внешних условий способен претерпевать конформационный переход из α-спиральной в β-конформацию и участвует в свертывании β-амилоида в фибриллы. Полученные структурные данные согласуются с данными ИФА и вестерн-блоттинга, которые показывают, что D3-пептид динамически связывается вблизи сайта узнавания α-секретазы, расположенного между внеклеточным катионсвязывающим доменом и подвижной JM-спиралью АРР. Также было протестировано влияние ряда патогенных мутаций, локализованных в различных структурных и функциональных частях АРР, на связывание D3-пептида.

Полученные данные свидетельствуют о том, что D-энантиомерный пептид D3 распознает амилоидогенный участок мембранного белка АРР еще до его процессинга, ограничивая конформационное разнообразие, не нарушая его α-спиральности, и предотвращая образование межмолекулярных водородных связей. Это создаёт предпосылки для ингибирования ранних стадий превращения Аβ пептидов в β-конформацию и последующей токсической олигомеризации, связанной с ранними стадиями развития болезни Альцгеймера [3]. Достигнутый прогресс в понимании молекулярного механизма действия D3-пептида является важным шагом на пути к разработке эффективной стратегии лечения и профилактики болезни Альцгеймера.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 23-74-00024).

Ссылки:

1. Urban A.S. et al. Structural Studies Providing Insights into Production and Conformational Behavior of Amyloid-β Peptide Associated with Alzheimer's Disease Development. Molecules. 2021;26(10):2897.

2. Klein A.N., Gremer L., Kutzsche J., Willbold D. et al. Optimization of d-Peptides for Aβ Monomer Binding Specificity Enhances Their Potential to Eliminate Toxic Aβ Oligomers. ACS Chemical Neuroscience. 2017;8(9):1889-1900.

3. Bocharov E.V. et al. All-d-Enantiomeric Peptide D3 Designed for Alzheimer's Disease Treatment Dynamically Interacts with Membrane-Bound Amyloid-β Precursors. Journal of Medicinal Chemistry. 2021;64(22):16464-16479.

Alzheimer’s disease is a devastating neurodegenerative disease resulting in severe dementia. Detailed information on the structure, dynamics, and various intermolecular interactions for biomolecules directly involved in the development of Alzheimer’s disease is required for the rational development of new biologically active compounds and screening of existing ones to obtain the most effective candidates for medicines [1]. Genetic evidence strongly suggests that aberrant generation and/or clearance of the neurotoxic amyloid-β peptide (Aβ), being the products of sequential cleavage of amyloid precursor protein (APP), triggers the disease. Aβ accumulates at the contact points of neurons as ordered strands and fibrils, forming the so-called senile plaques. At the same time, Aβ isoforms of various lengths are found in the brain of healthy people regardless of age and, apparently, play a role in signaling pathways in the brain and have neuroprotective properties at low concentrations.

All-D-enantiomeric peptide D3 and its derivatives were recently selected with the aid of phage display to directly destroy cytotoxic Aβ aggregates [2]. Currently, one of the D3-like compounds is about to undergo a phase II clinical trial, however, high resolution molecular details of its disease preventing or pharmacological action are not completely clear. To solve the problem, we used complex approach based on biochemical and biophysical methods such as protein engineering, microscopic thermophoresis, fluorescence confocal microscopy, fluorescence polarization, microfluidic diffusion calibration, circular dichroism, high resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and computer simulation. We present experimental evidence showing that D3-peptide, being an intrinsically disordered peptide (IDP), can dynamically and specifically bind in IDP/IDP-like manner to the extracellular juxtamembrane (JM) region of membrane-bound Aβ precursor, CTFβ transmembrane fragment of amyloid precursor protein (APP672-726, Aβ1-55 in amyloid-β numeration). Namely, heteronuclear NMR spectroscopy showed that D3-peptide directly binds to the amphiphilic near-membrane JM region of Aβ17-26, which, depending on external conditions, is capable of undergoing a conformational transition from the α-helical conformation to the β-chain, which is involved in folding of β-amyloid into fibrils. The obtained structural data in agreement with ELISA and Western-blot analyzes, which reveal that D3-peptide dynamically binds in the vicinity of α-secretase recognition site situated between the extracellular cation-binding domain and JM helix of APP. The influence of a number of pathogenic mutations located in different structural and functional parts of APP on the peptide binding was also tested.

The data suggest that D-enantiomeric peptide D3 recognizes the amyloidogenic region of APP also before its processing, restricting conformational diversity not compromising its α-helicity and preventing intermolecular hydrogen bond formation, which would create prerequisites for inhibition of early steps of Aβ conversion into β-conformation and its toxic oligomerization associated with early stages of Alzheimer’s disease development [3]. The achieved progress in understanding the molecular mechanism of D3-peptide action is an important step towards development of an effective treatment and prevention strategy of Alzheimer’s disease.

The study is supported by Russian Science Foundation (project #23-74-00024).

References:

1. Urban A.S. et al. Structural Studies Providing Insights into Production and Conformational Behavior of Amyloid-β Peptide Associated with Alzheimer's Disease Development. Molecules. 2021;26(10):2897.

2. Klein A.N., Gremer L., Kutzsche J., Willbold D. et al. Optimization of d-Peptides for Aβ Monomer Binding Specificity Enhances Their Potential to Eliminate Toxic Aβ Oligomers. ACS Chemical Neuroscience. 2017;8(9):1889-1900.

3. Bocharov E.V. et al. All-d-Enantiomeric Peptide D3 Designed for Alzheimer's Disease Treatment Dynamically Interacts with Membrane-Bound Amyloid-β Precursors. Journal of Medicinal Chemistry. 2021;64(22):16464-16479.