Болезнь Альцгеймера (БА) на данный момент является самым распространенным нейродегенеративным заболеванием в мире, приводящим к постепенной потере памяти и полной утрате когнитивных функций пациентов. Существует несколько гипотез развития этого заболевания. Наиболее распространенной является амилоидная гипотеза, согласно которой нейродегенерация при БА вызвана накоплением в тканях мозга β-амилоида болезни Альцгеймера (Аβ). В организме здорового человека Аβ образуется в небольших количествах путем расщепления белка-предшественника амилоида (APP). Длина Аβ варьирует от 37 до 43 аминокислот и, предположительно, он необходим для регуляции синаптической активности, активации ряда сигнальных каскадов, защиты и восстановления мозга после инфекций и травм. Наблюдаемые в патогенезе БА нарушения метаболизма Аβ, в частности, наиболее нейротоксичного Аβ(1-42), могут быть вызваны такими факторами, как мутация в белке APP или дисрегуляция активности β-секретазы, участвующей в процессинге APP по амилоидогенному пути. При этом происходит накопление Аβ(1-42) и образование токсических олигомеров, а также агрегация амилоида во внеклеточной среде с образованием характерных для более поздних стадий БА сенильных бляшек.

Мономеры и олигомеры Аβ могут влиять на функционирование целого ряда ферментов в клетках. Одной из мишеней амилоида является фермент Na,K-АТФаза, создающий трансмембранный градиент Na+ и K+, необходимый для нормального функционирования нейронов [1]. Ингибирование Na,K-АТФазы β-амилоидом является одной из причин нарушения электрогенных свойств нейронов при БА. Кроме транспортной функции, известна рецепторная функция Na,K-АТФазы, включающая в себя ее участие в ряде сигнальных каскадов и, в частности, активацию Src-киназы.

Активность внутриклеточной Src-киназы преимущественно регулируется за счет двух ее модификаций: ингибирующего фосфорилирования по Y527 и активирующего аутофосфорилирования по Y416. Однако помимо этого Src способна образовывать комплекс с Na,K-АТФазой. В этом взаимодействии задействованы два домена Src-киназы: регуляторный SH2- и киназный домены [2]. Связывание киназного домена Src с Na,K-АТФазой препятствует ее аутофосфорилированию, однако при взаимодействии Na,K-АТФазы с лигандом, например, кардиотоническим стероидом уабаином, киназный домен Src-киназы высвобождается, происходит ее аутофосфорилирование по Y416 и, следовательно, активация.

Нами было обнаружено, что в in vitro системе связывание Аβ(1-42) с Na,K-АТФазой вызывает аналогичный эффект активации Src-киназы [3]. Обратный пептид Аβ(42-1) таким действием не обладает, что свидетельствует о специфичности взаимодействия. Важно, что в отсутствие Na,K-АТФазы добавление Аβ(1-42) не влияет на уровень фосфорилирования Src-киназы по Y416. Эти данные, в совокупности с данными, полученными на клетках, свидетельствуют о том, что Na,K-АТФаза является рецептором к β-амилоиду, и вследствие их взаимодействия активируется Src [3]. Так как Src-киназа играет важную роль во множестве клеточных процессов, нарушенных в патогенезе БА и включающих в себя нейрогенез, регуляцию экспрессии и чувствительности ряда рецепторов, то ее патологическая активация вследствие повышенного уровня Аβ при БА может вносить вклад в патогенез болезни. Таким образом, нарушение взаимодействия Src-киназы и Na,K-АТФазы является перспективной мишенью для терапии БА. Для понимания функционирования комплекса Na,K-АТФазы с Src-киназой и создания подходов для поиска ингибиторов их взаимодействия необходимо охарактеризовать интерфейс взаимодействия Na,K-АТФазы и Src-киназы в различных состояниях.

С помощью метода микротермофореза нами была получена константа диссоциации нефосфорилированной Src-киназы с Na,K-АТФазой, составляющая 0.21 ± 0.04 µМ [3]. Также были оценены константы диссоциации для Src-киназы, фосфорилированной по Y416 и Y527, с Na,K-АТФазой.

Для того чтобы установить, с какими формами Src-киназы связана Na,K-АТФаза в клетке, нами была получена фракция Src-киназы из лизатов клеток нейробластомы человека SH-SY5Y, коиммунопреципитированной с α1-субъединицей Na,K-АТФазы, и проведено сравнение уровня фосфорилирования по Y416 и Y527 относительно общей фракции Src-киназы из лизатов клеток. Было установлено, что Src-киназа с ингибирующим фосфорилированием по Y527 в комплексе с Na,K-АТФазой не детектируется, в то время как Src-киназа с активирующим фосфорилированием детектируется, что особенно выражено при добавлении уабаина.

Интерфейсы взаимодействия Na,K-АТФазы с Src-киназой были предсказаны с помощью докинга. В ходе моделирования данных комплексов были использованы существующие структуры нефосфорилированной и фосфорилированной по Y527 Src-киназ, которые не включают в себя неупорядоченный N-концевой домен SH4UD, до сих пор не поддающийся кристаллизации ввиду непостоянства его структуры. Однако существуют данные, свидетельствующие о том, что данный домен может играть роль в регуляции активности Src-киназы [4]. Поэтому нами были получены равновесные конформации полноразмерной структуры Src-киназы с N-концевым доменом SH4UD методом REHT MD и установлены интерфейсы взаимодействия полноразмерной Src с Na,K-АТФазой. Сравнение комплексов полноразмерной Src-киназы и Src-киназы без домена SH4UD с Na,K-АТФазой позволит оценить роль N-концевого домена SH4UD во взаимодействии Src с Na,K-АТФазой.



Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-74-30007).



Список литературы:

1. Irina Yu Petrushanko et al. Direct interaction of beta-amyloid with Na,K-ATPase as a putative regulator of the enzyme function // Scientific Reports. 2016. №6.

2. Boczek et al. Autophosphorylation activates c-Src kinase through global structural rearrangements // Journal of Biological Chemistry. 2019. №35.

3. Irina Yu Petrushanko et al. Na,K-ATPase Acts as a Beta-Amyloid Receptor Triggering Src Kinase Activation // Cells. 2022. №11.

4. Pérez et al. Lipid binding by the Unique and SH3 domains of c-Src suggests a new regulatory mechanism // Scientific Reports. 2013. №3.

Alzheimer’s disease (AD) is nowadays the most widespread neurodegenerative disease in the world, which causes progressive cognitive decline and memory loss. There are different hypotheses regarding the development of this disease. The most common is amyloid hypothesis, according to which neurodegeneration observed in AD pathogenesis is caused by accumulation of amyloid beta (Aβ) protein, a proteolytic byproduct of amyloid-beta precursor protein (APP) normally present in human body at low concentrations. Aβ peptide varies in length from 37 to 43 amino acids and is thought to be involved in synaptic activity regulation, a number of signalling pathways, protection from brain infections and posttraumatic brain recovery. The metabolic disorder of Aβ, especially of Aβ(1-42) which is known to be the most neurotoxic type, observed in AD pathogenesis can be caused by such factors as APP mutations and β-secretase dysregulation, the enzyme involved in the abnormal amyloidogenic proteolysis of APP. In this way, the accumulation of Aβ leads to generation of toxic oligomers of Aβ and its aggregation and deposition in the extracellular space forming distinctive senile plaques.

Monomers and oligomers of Aβ effect on the functionality of various enzymes in the cells. One of the affected enzymes is Na,K-ATPase, the enzyme that maintains the resting membrane potential essential for normal functionality of neurons, thus inhibition of its activity leads to the neuronal electrogenic malfunction observed in patients with AD [1]. Apart from ion transport, Na,K-ATPase is known for its receptor function, which involves numerous signalling pathways and, in particular, Src kinase activation.

The activity of unbound cellular Src is mainly regulated by its two modifications: the inhibiting tyrosine-527 (Y527) phosphorylation and activating tyrosine-416 (Y416) autophosphorylation. But besides that, Src kinase can form a complex with Na,K-ATPase involving two Src domains: regulatory SH2-domain and kinase domain [2]. Binding to Na,K-ATPase prevents the kinase domain from autophosphorylation, however, when the ligand, such as cardiotonic steroid ouabain, is bound to Na,K-ATPase, the kinase domain of Src is released, autophosphorylates by Y416 and, as a result, Src kinase is activated.

We have found that binding Aβ(1-42) to Na,K-ATPase in vitro also results in Src activation [3]. The specificity of Aβ-induced Src activation was proved by the reverse peptide Аβ(42-1) which did not show any activating effect. Of note, Аβ(1-42) in the absence of Na,K-ATPase did not activate Src. This data, together with data obtained from cell experiments, show that Na,K-ATPase appears to be a receptor to Aβ(1-42) triggering Src activation [3]. As Src plays an important role in numerous cellular processes, including neurogenesis, regulation of expression and activity of receptors, the neurotoxic effects of Aβ and demential processes in AD may be associated with the long-term activation of Src through Na,K-ATPase:Aβ interaction, thus making the interaction between Src and Na,K-ATPase the potential therapeutic target.

The full investigation of complex Src:Na,K-ATPase is required for the development the ways of searching for the inhibitors of their interaction and understanding of how this complex works.

We obtained the dissociation constant for dephosphorylated Src:Na,K-ATPase complex equal to 0.21 ± 0.04 µМ using MicroScale thermophoresis [3]. Further, we measured the dissociation constants for phosphorylated by Y416 and Y527 Src:Na,K-ATPase.

In order to investigate which modifications of Src are bound by Na,K-ATPase in cells, the neuroblastoma culture SH-SY5Y was used. The cells were lysed, and Src was co-immunopreciputated with Na,K-ATPase α1-subunit. Then, the levels of Src phosphorylation by Y416 and Y527 were measured and compared to those in total cell lysates. The obtained data show, that Src with inhibiting phosphotyrosine-527 cannot be detected after the co-immunoprecipitation, yet co-immunoprecipitated Src with activating phosphotyrosine-416 is detected in the presence of ouabain.

The interaction interfaces of Na,K-ATPase and Src kinase in the dephosphorylated and phosphorylated by Y527 states were predicted using molecular docking. In this modeling, the existing structures obtained from PDB were used. These structures do not include N-terminal SH4-unique domain (SH4UD), which has not been crystallized yet due to its unstable conformation. However, this domain has been shown to play regulatory role in Src kinase activity. Therefore, we obtained equilibrium conformations of Src kinase with SH4UD using REHT MD and predicted the interaction interfaces of full-length Src with Na,K-ATPase. The comparison of predicted interaction interfaces for full-length Src and Src without SH4UD may help understand the role of SH4UD in Src:Na,K-ATPase interaction.



This research was funded by Russian Science Foundation (Grant No. #19-74-30007).



References:

1. Irina Yu Petrushanko et al. Direct interaction of beta-amyloid with Na,K-ATPase as a putative regulator of the enzyme function // Scientific Reports. 2016. №6.

2. Boczek et al. Autophosphorylation activates c-Src kinase through global structural rearrangements // Journal of Biological Chemistry. 2019. №35.

3. Irina Yu Petrushanko et al. Na,K-ATPase Acts as a Beta-Amyloid Receptor Triggering Src Kinase Activation // Cells. 2022. №11.

4. Pérez et al. Lipid binding by the Unique and SH3 domains of c-Src suggests a new regulatory mechanism // Scientific Reports. 2013. №3.