Большинство видов РНК в эукариотических клетках синтезируется ДНК-зависимой РНК-полимеразой 2 (РНКП 2). Ядерная ДНК у эукариот организована в хроматин - комплекс нуклеиновых кислот и белков, базовой единицей которого является нуклеосома. Нуклеосома состоит из фрагмента ДНК длиной 147 п.н., плотно упакованного на октамере белков-гистонов [Luger et al., 1997], и представляет собой барьер для транскрипции [Bondarenko et al., 2006]. При умеренном уровне транскрипции РНКП 2 гистоны преимущественно сохраняются на ДНК за счет специфического РНКП 2-зависимого механизма элонгации, сохраняющегося у эукариотических организмов от дрожжей до человека [Kulaeva et al., 2009].

Ранее было показано, что транскрипция нуклеосом по РНКП 2-зависимому механизму сопровождается образованием небольших петель ДНК на поверхности октамера гистонов, включающих сам фермент - внутринуклеосомных петель [Kulaeva et al., 2009; Pestov et al., 2015; Gerasimova et al., 2016]. Формирование таких структур предположительно связано с сохранением гистонов на ДНК при транскрипции [Kulaeva et al., 2009; Gerasimova et al., 2016]. Внутринуклеосомные петли ДНК намного эффективнее формируются в присутствии однонитевых разрывов нематричной цепи ДНК, вызывая арест транскрибирующей РНКП [Pestov et al., 2015; Gerasimova et al., 2022]. В ходе структурных исследований интермедиата транскрипции, содержащего внутринуклеосомную петлю, было обнаружено, что после того, как РНКП минует разрыв ДНК, происходит откат фермента («бэктрекинг»), а ДНК позади него взаимодействует с поверхностью октамера гистонов, образуя внутринуклеосомную петлю, которая блокирует дальнейшее продвижение фермента [Gerasimova et al., 2022].

В настоящей работе была изучена роль N-концевых «хвостов» гистонов и вненуклеосомных однонитевых разрывов нематричной цепи ДНК в формировании внутринуклеосомных петель ДНК и аресте РНКП при транскрипции ближайшего к промотору участка нуклеосомной ДНК [Gerasimova et al., 2022]. Было обнаружено, что разрывы в линкерной ДНК вызывают остановку РНКП в положениях от +1 до +15 п.н. от входа в нуклеосому, что свидетельствует в пользу образования в этих положениях внутринуклеосомных петель ДНК. Остановка фермента более эффективно происходит в присутствии «хвостов» гистонов, что позволяет предположить их участие в образовании или стабилизации структуры внутринуклеосомных петель. Методом футпринтинга ДНК подтверждено предположение об образовании внутринуклеосомной петли в положении +1. Поскольку формирование внутринуклеосомных петель ДНК происходит с большей эффективностью в присутствии однонитевых разрывов ДНК, расположенных позади фермента, такие структуры могут играть роль в узнавании повреждений ДНК, скрытых в хроматиновой структуре.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-64-00001).

Литература

1. Bondarenko, V. A., Steele, L. M., Ujvári, A., Gaykalova, D. A., Kulaeva, O. I., Polikanov, Y. S., Luse, D. S., and Studitsky, V. M. (2006) Nucleosomes can form a polar barrier to transcript elongation by RNA polymerase II, Molecular Cell, 24, 469-479, doi: 10.1016/j.molcel.2006.09.009.

2. Gerasimova, N. S., Pestov, N. A., Kulaeva ,O. I., Clark, D. J., and Studitsky, V.M. (2016) Transcription-induced DNA supercoiling: New roles of intranucleosomal DNA loops in DNA repair and transcription, Transcription, 26;7(3):91-5. doi: 10.1080/21541264.2016.1182240.

3. Gerasimova NS, Volokh OI, Pestov NA, Armeev GA, Kirpichnikov MP, Shaytan AK, Sokolova OS, Studitsky VM. Structure of an Intranucleosomal DNA Loop That Senses DNA Damage during Transcription. Cells. 2022 Aug 28;11(17):2678. doi: 10.3390/cells11172678.

4. Gerasimova NS, Pestov NA, Studitsky VM. Role of Histone Tails and Single Strand DNA Breaks in Nucleosomal Arrest of RNA Polymerase. Int J Mol Sci. 2023 Jan 24;24(3):2295. doi: 10.3390/ijms24032295.

5. Kulaeva, O. I., Gaykalova, D. A., Pestov, N. A., Golovastov, V. V., Vassylyev, D. G., Artsimovitch, I., and Studitsky, V. M. (2009) Mechanism of chromatin remodeling and recovery during passage of RNA polymerase II, Nature Structural and Molecular Biology, 16, 1272-1278, doi: 10.1038/nsmb.1689.

6. Luger, K.; Mäder, A.W.; Richmond, R.K.; Sargent, D.F.; Richmond, T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 1997, 389, 251-260, doi:10.1038/38444.

7. Pestov NA, Gerasimova NS, Kulaeva OI, Studitsky VM. Structure of transcribed chromatin is a sensor of DNA damage. Sci Adv. 2015 Jul 3;1(6):e1500021. doi: 10.1126/sciadv.1500021.

The majority of RNA molecules in eukaryotic cells are produced by DNA-dependent RNA polymerase 2 (RNAP 2). Nuclear DNA in eukaryotes is organized into a chromatin – a complex of nucleic acids and proteins with a nucleosome as a basic unit. Nucleosome consists of a 147-bp DNA fragment tightly packed on an octamer of core histone proteins [Luger et al., 1997] presenting a barrier for transcribing RNAPs [Bondarenko et al., 2006]. Moderate transcription through chromatin by RNAP 2 is accompanied by survival of the core histone proteins on the DNA due to specific RNAP 2 type mechanism of elongation conserved from yeasts to human [Kulaeva et al., 2009].

Transcription through nucleosomes by RNAP 2-type mechanism is accompanied by formation of small DNA loops on the histone octamer containing the enzyme (intranucleosomal loops, or i-loops) [Kulaeva et al., 2009; Pestov et al., 2015; Gerasimova et al., 2016]. Formation of these structures are presumably involved in survival of core histones on the DNA [Kulaeva et al., 2009; Gerasimova et al., 2016]. These i-loops form much more efficiently in the presence of single-strand DNA breaks in a non-template DNA strand (NT-SSBs) inducing arrest of transcribing RNAP [Pestov et al., 2015], and thus allowing detection of the damages by the enzyme. Structural studies of transcription intermediate containing i-loop reveals, that after RNAP passes the damage, the enzyme can backtrack, and DNA behind it recoils on the surface of the histone octamer, forming an i-loop that locks RNAP in the arrested state [Gerasimova et al., 2022].

Here we examined the role of N-terminal tails of core histone proteins and extranucleosomal NT-SSBs on the i-loop formation and arrest of RNAP during transcription of promoter-proximal region of nucleosomal DNA [Gerasimova et al., 2023]. It was found, that NT-SSBs in linker DNA induce arrest of RNAP at the positions +1 to +15 bp in the nucleosome from the promoter-proximal boundary, suggesting formation of the i-loops in these positions. The arrest of the enzyme is more efficient in the presence of the histone tails. Consistently, DNA footprinting assay reveals formation of an i-loop after stalling RNAP at the position +2 and backtracking to position +1. The data suggest that histone tails and NT-SSBs present in linker DNA strongly facilitate formation of the i-loops during transcription through promoter-proximal region of nucleosomal DNA.

Our newly obtained data suggests an important role of N-terminal tails of core histones in formation of i-loop structures. Since the i-loops are formed much more efficiently in the presence of SSBs positioned behind the transcribing enzyme, the loops likely play a role in transcription-coupled repair of DNA damages hidden in chromatin structure.

This work was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 21-64-00001).

References:

1. Bondarenko, V. A., Steele, L. M., Ujvári, A., Gaykalova, D. A., Kulaeva, O. I., Polikanov, Y. S., Luse, D. S., and Studitsky, V. M. (2006) Nucleosomes can form a polar barrier to transcript elongation by RNA polymerase II, Molecular Cell, 24, 469-479, doi: 10.1016/j.molcel.2006.09.009.

2. Gerasimova, N. S., Pestov, N. A., Kulaeva ,O. I., Clark, D. J., and Studitsky, V.M. (2016) Transcription-induced DNA supercoiling: New roles of intranucleosomal DNA loops in DNA repair and transcription, Transcription, 26;7(3):91-5. doi: 10.1080/21541264.2016.1182240.

3. Gerasimova NS, Volokh OI, Pestov NA, Armeev GA, Kirpichnikov MP, Shaytan AK, Sokolova OS, Studitsky VM. Structure of an Intranucleosomal DNA Loop That Senses DNA Damage during Transcription. Cells. 2022 Aug 28;11(17):2678. doi: 10.3390/cells11172678.

4. Gerasimova NS, Pestov NA, Studitsky VM. Role of Histone Tails and Single Strand DNA Breaks in Nucleosomal Arrest of RNA Polymerase. Int J Mol Sci. 2023 Jan 24;24(3):2295. doi: 10.3390/ijms24032295.

5. Kulaeva, O. I., Gaykalova, D. A., Pestov, N. A., Golovastov, V. V., Vassylyev, D. G., Artsimovitch, I., and Studitsky, V. M. (2009) Mechanism of chromatin remodeling and recovery during passage of RNA polymerase II, Nature Structural and Molecular Biology, 16, 1272-1278, doi: 10.1038/nsmb.1689.

6. Luger, K.; Mäder, A.W.; Richmond, R.K.; Sargent, D.F.; Richmond, T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 1997, 389, 251-260, doi:10.1038/38444.

7. Pestov NA, Gerasimova NS, Kulaeva OI, Studitsky VM. Structure of transcribed chromatin is a sensor of DNA damage. Sci Adv. 2015 Jul 3;1(6):e1500021. doi: 10.1126/sciadv.1500021.