Внимание к полифункциональным белкам характерно для современной молекулярной биофизики и структурной биологии. Большинство таких белков являются мультидоменными или мультисубъединичными. Разные функции этих белков могут обеспечиваться работой разных модулей, эволюционно объединенных в одну белковую глобулу. Однако недавно были идентифицированы белки, способные выполнять разные функции, не имея для этого специальных структурных модулей. Было предложено несколько методов in silico для их идентификации таких белков, названных «белки лунного света», а также белков с экспериментально подтвержденной многофункциональностью, которые собраны в базе данных MoonProt, включающей и Dps.

Было ясно, что, будучи одним из основных белков бактериального нуклеоида, преимущественно продуцируемый во время стационарной фазы роста бактерий, Dps также действует как ферритин, окисляя токсичное ионы железа и накапливая Fe(III) во внутренней полости, образованной 12 идентичными субъединицами. Окисление Fe(II) катализируется перекисью водорода в ферроксидазных центрах расположенных на стыках субъединиц. Опосредованная Dps конденсация бактериального нуклеоида в стационарной фазе роста в основном происходит за счет присутствия положительно заряженных аминокислотных остатков в его неструктурированных N-концевых модулях. Электростатически прикрепляясь к отрицательно заряженному остову ДНК, они могут способствовать взаимодействию белка с любыми локусами генома. Однако эксперименты Chip-seq и SELEX in vitro выявили неслучайное распределение сайтов связывания Dps по всему бактериальному геному.

Другой интересной особенностью Dps является его пространственное распределение в бактериальных клетках. Обнаруженный как нуклеоидный белок голодающих клеток, он, как и ожидалось, был обнаружен в ассоциации с ДНК. Однако воздействие бактериофагов окружающей среды на E. coli MG1655 привело к отбору фаготолерантных бактерий с повышенным образованием биопленок, которые продуцировали фибрилоподобные структуры и накапливали Dps во фракции белков внешней мембраны. Мембранное расположение этого белка изучено плохо, но, изучая белки наружной мембраны, участвующие в резистентности к стрептомицину было показано, что, наряду с активируемыми белками (TolC, OmpT и LamB) E. coli, также присутствует три белка (FadL, OmpW и Dps) у штамма, устойчивого к антибиотикам. Вероятно, присутствие Dps на мембране нельзя объяснить только ее утечкой из мертвых клеток вместе, например, с ДНК. Поэтому, целью данного исследования являлась оценка возможности мембранной локализации многфункционального олигомера Dps E.coli.

Для оценки принципиальной способности Dps взаимодействовать с липидами из соевого лецитина были получены искусственные липосомы, широко используемые в качестве систем доставки лекарств. Среднее значение диметра полученных липосом составляло 103 нм, что давало избыток молекул Dps (0.55 мМ) от 7.6 до 30.4 раз, при добавлении 20-5 мкл суспензии липосом к раствору белка. Хотя такой большой избыток затруднял обнаружение опосредованного липосомами снижение содержания молекул Dps в экспериментах с использованием метода задержки в геле (EMSA), было зарегистрировано снижение их до 41,6 и 53,7% в присутствии 20 и 15 мкл свежеприготовленных липосом. Это, в целом, указывает на способность Dps связывать мембранные фосфолипиды, вероятно, способом, сходным с сахаро-фосфатным остовом ДНК.

На следующем этапе было проверено предположение о способности клеток E.coli K12 MG1655 содержать Dps на своей поверхности. Для этого бактериальные клетки выращивали до максимального внутриклеточного содержания Dps на питательной среде LB до стационарной фазы (16 и 72 часа). После чего клетки визуализировали с использованием конфокальной микроскопии и антител, несущих флуоресцентный краситель Alexa Fluor 488. В результате было обнаружено около 20% клеток с зеленой флуоресценцией без явной зависимости их количества от времени устойчивого роста. Окрашивание бактерий красным флуоресцентным белком (RFP), полученным с использованием плазмиды pET28b-mCherry, подтвердило присутствие Dps на поверхности клеток и выявило его способность образовывать характерные зернистые структуры. При это подобного результата не наблюдалось для мутанта dps-null, что позволяет предположить, что эти структуры формируются как минимум при участии Dps и свидетельствует об отсутствии значимой перекрестной реактивности антител с другими поверхностными белками E. coli.

Для оценки зависимости этого явления от концентрации клеточного Dps, были использовны клетки E. coli XL-1 Blue. После 16 часов культивирования примерно такой же процент клеток демонстрировал Dps на своей поверхности, как и для клеток E. coli k12 MG1655. Собирая бактерии при различной оптической плотности (OD600 = 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0), было зарегистрировано ожидаемое увеличение процента клеток с зеленой флуоресценцией на поверхности. Трансформируя синие клетки E. coli XL-1 Blue с помощью pGEMΔXba_dps, несущей ген dps под контролем промотора РНК-полимеразы T7 и индуцируя его экспрессию с помощью IPTG, мы получили резко увеличенное количество зеленых клеток. Однако большинство из них образовывало крупные агрегаты, где процент клеток с мембранной локализацией Dps корректно оценить невозможно. Поэтому мы оценили его для отдельно расположенных клеток, и он оказался выше, чем для клеток, выращенных до той же оптической плотности без добавления IPTG. Таким образом, стало ясно, что миграция Dps на клеточную поверхность зависит от его клеточной концентрации. Поскольку агрегаты, образованные клетками E. coli K12 MG1655, выращенными до поздней стационарной фазы (72 ч), обычно не были значительно обогащены зелеными клетками, возможно, что IPTG-индуцированное перепроизводство этого белка облегчает агрегацию.

Исследование выполнено при поддержке РНФ в рамках проекта N 18-14-00348

Attention to polyfunctional proteins is characteristic of modern molecular biophysics and structural biology. Most of these proteins are multidomain or multisubunit. Different functions of these proteins can be provided by the work of different modules, evolutionarily combined into one protein globule. However, recently proteins have been identified that are capable of performing various functions without having special structural modules for this. Several in silico methods have been proposed for their identification of such proteins, called "moonlight proteins", as well as proteins with experimentally confirmed multifunctionality, which are collected in the MoonProt database, which includes Dps.

It was clear that, being one of the main proteins of the bacterial nucleoid, predominantly produced during the stationary phase of bacterial growth, Dps also acts as ferritin, oxidizing toxic iron ions and accumulating Fe(III) in an internal cavity formed by 12 identical subunits. The oxidation of Fe(II) is catalyzed by hydrogen peroxide in the ferroxidase centers located at the junctions of subunits. Dps-mediated condensation of a bacterial nucleoid in the stationary phase of growth mainly occurs due to the presence of positively charged amino acid residues in its unstructured N-terminal modules. By electrostatically attaching to the negatively charged DNA backbone, they can facilitate the interaction of the protein with any loci of the genome. However, in vitro Chip-seq and SELEX experiments revealed a nonrandom distribution of Dps binding sites throughout the bacterial genome.

Another interesting feature of Dps is its spatial distribution in bacterial cells. Discovered as a nucleoid protein of starving cells, it was found, as expected, in association with DNA. However, the impact of environmental bacteriophages on E. coli MG1655 led to the selection of phagotolerant bacteria with increased biofilm formation, which produced fibril-like structures and accumulated Dps in the outer membrane protein fraction. The membrane location of this protein is poorly understood, but by studying the outer membrane proteins involved in streptomycin resistance, it has been shown that along with the activated proteins (TolC, OmpT and LamB) of E. coli, three proteins are also present (FadL, OmpW and Dps) in a strain resistant to antibiotics. Probably, the presence of Dps on the membrane cannot be explained only by its leakage from dead cells together, for example, with DNA. Therefore, the purpose of this study was to evaluate the possibility of membrane localization of the multifunctional E. coli Dps oligomer.

To assess a principal ability of Dps to interact with lipids, the artificial liposomes widely used as drug delivery systems were obtainedfrom the soybean lecithin. The peak maximum in their size distribution corresponded to 103 nm, which gave 7.6 – 30.4 fold excess of the Dps particles taken in 0.55 mM concentration, when 20-5μl of liposome suspension was added to the protein solution. Although such a large excess hampered detection of liposome-mediated depletion of free Dps in band-shift experiments, we observed a decrease to 41.6 and 53.7% of unbound Dps in the presence of 20 or 15 microliters of freshly prepared liposomes. Indicating the ability of Dps to bind membrane phospholipids, probably in a manner similar to the sugar-phosphate backbone of DNA, this made further studies appropriate.

In the first step, we tested whether E. coli K12 MG1655 cells can exhibit Dps on their surface. Bacteria were grown in LB medium until stationary phase (16 and 72 hours), when the cellular concentration of Dps is maximal. They were prepared for confocal microscopy and the protein was visualized using green fluorescence dye Alexa Fluor 488 as described in Materials and Methods. As a result, we found about 20% of cells with green fluorescence with no apparent dependence of their number on the time of steady growth. Staining the bacteria with red fluorescent protein (RFP) derived from pET28b-mCherry confirmed the presence of Dps on the cell surface and revealed its ability to form distinctive granular structures. Nothing similar was observed for the dps-null mutant, assuming that these structures are formed at least with the participation of Dps and indicating the absence of significant cross-reactivity of antibodies with other E. coli surface proteins.

To assess the dependence of this phenomenon on cellular Dps concentration, we used E. coli XL-1 Blue cells. After 16 hours of cultivation, approximately the same percentage of cells exhibited Dps on their surface as estimated for E. coli k12 MG1655 cells. Harvesting bacteria at different optical densities (OD600 = 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0) we observed an expected increase in the percentage of cells with green fluorescence.

By transforming E. coli XL-1 Blue cells with pGEMΔXba_dps, carrying the dps gene under the control of the T7 RNA polymerase promoter, and inducing its expression with IPTG we obtained a sharply increased amount of green cells. However, most of them formed large aggregates where the percentage of cells with membrane bond Dps was impossible to estimate correctly. Therefore, we assessed it for separately located cells, and it turned out to be higher than for cells grown to the same OD without IPTG. Thus, it became clear that Dps migration to the cell surface depends on its cellular concentration. Since aggregates formed by E. coli K12 MG1655 cells grown to late stationary phase (72 h) were not usually significantly enriched in green cells, it is possible that IPTG-induced overproduction of this protein facilitates aggregation.

The study was supported by the RSF, project N 18-14-00348