Продукция антител к рецепторам глутамата типа NMDA, обнаружена у пациентов со многими неврологическими и психическими расстройствами. Антитела против различных глутаматных рецепторов, включая AMPA-GluR3, NMDA-NR1, NMDA-NR2A/B, mGluR1 или mGluR5, присутствуют в субпопуляциях пациентов с эпилепсией, энцефалитом, мозжечковой атаксией, системной красной волчанкой (СКВ) и нейропсихиатрической СКВ, синдромом Шегрена, шизофренией, манией или инсультом. Эти аутоиммунные антитела к рецепторам глутамата могут связывать нейроны в нескольких областях мозга, активировать рецепторы глутамата, снижать экспрессию рецепторов глутамата, нарушать индуцированную глутаматом передачу сигналов и функцию, активировать эндотелиальные клетки гематоэнцефалического барьера, убивать нейроны, повреждать мозг, вызывать поведенческие, психиатрические или когнитивные расстройства. Но патогенетические механизмы этих явлений остаются неизученными. Исследования протеолиза нейроспецифических белков сывороточными антителами (абзимами), которые могли бы установить молекулярные особенности нарушения нейроимунных взаимодействий, лежащих в основе вышеперечисленных заболеваний, обладают высокой степенью актуальности. В данной работе изучена каталитическая активность IgG в отношении рекомбинантных субъединиц NR1 и NR2 NMDA рецептора в эксперименте in vitro. Рекомбинантная модель субъединиц включала в себя пептидные фрагменты из наиболее функционально активных участков субъединиц рецептора. Для этого были сконструированы два химерных белка DBD-NMDAR1 и DBD-NMDAR2, содержащих фрагменты NR1 и NR2 субъединиц на основе плазмиды pL761.Плазмида pL761 была сконструирована на основе вектора pR1504, содержащего нуклеотидную последовательность декстрансвязывающего домена DBD1 из Leuconostoc mesenteroides, GS-спейсер и выбранную нуклеотидную последовательность, кодирующую субъединицу глутаматного рецептора NMDAR1 или NMDAR2.

Сывороточные IgG здоровых лиц были очищены методом аффинной хроматографии на колонке с Protein-G Sepharose. Принадлежность изучаемой активности непосредственно IgG была подтверждена электрофоретической гомогенностью; высокоэффективной гель–фильтрацией при рН 2,6; определением активности «in situ».

Реакционную смесь, содержащую 0,5 мг/мл белков DBD-NMDAR1 или DBD-NMDAR2 и 0,1 мг/мл IgG здоровых лиц, инкубировали в течение 9 часов при температуре 37°С. Оценку продуктов гидролиза субъединиц NR1 и NR2 иммуноглобулинами класса G производили посредством электрофореза и хромато-масс-спектрометрического анализа на масс-спектрометре OrbiTrap Elite (Thermo Scientific, Германия), соединенном с нанопотоковым хроматографом Easy-nLc 1000 (Thermo Scientific, США). Обработка результатов производилась с помощью программного обеспечения Thermo Xcalibur Qual Browser и PEAKS Studio-7.5.

Инкубация рекомбинантных белков DBD-NMDAR1 и DBD-NMDAR2 с препаратами IgG здоровых доноров приводила к снижению интенсивности полосы рекомбинантного белка на электрофореграмме, причем более эффективно шел гидролиз DBD-NMDAR2 белка.

Данные масс-спектрометрического анализа после соответствующей обработки показали следующие результаты. В случае гидролиза DBD-NMDAR1 белка количество идентифицированных пептидов (после гидролиза) из домена NR1 (среднее значение: 23 пептида) было значительно выше (p=0,005), чем из несущего домена DBD (10 пептидов). В случае DBD-NMDAR2 количество идентифицированных пептидов из домена NR2 (60 пептидов) также было достоверно выше (p=0,017), чем из несущего домена DBD (45 пептидов).

Инкубация рекомбинантных белков DBD-NMDAR1 и DBD-NMDAR2 с препаратами IgG здоровых доноров приводила к снижению интенсивности полосы рекомбинантного белка на электрофореграмме, причем более эффективно шел гидролиз DBD-NMDAR2 белка.

Данные масс-спектрометрического анализа после соответствующей обработки показали следующие результаты. В случае гидролиза DBD-NMDAR1 белка количество идентифицированных пептидов (после гидролиза) из домена NR1 (среднее значение: 23 пептида) было значительно выше (p=0,005), чем из несущего домена DBD (10 пептидов). В случае DBD-NMDAR2 количество идентифицированных пептидов из домена NR2 (60 пептидов) также было достоверно выше (p=0,017), чем из несущего домена DBD (45 пептидов).

Таким образом, впервые показано, что сывороточные IgG здоровых лиц гидролизуют NR1 и NR2 субъединицы NMDA рецептора в эксперименте in vitro, причем гидролиз субъединиц рецептора достоверно превышает гидролиз других участков химеры. При этом более активному гидролизу антителами подвергается белок DBD-NMDAR2. Учитывая высокую патогенетическую значимость нарушения работы NMDA рецепторов при психических и неврологических расстройствах, новые знания о протеолитических абзимах могут способствовать установлению новых молекулярных механизмов развития заболеваний.

Работа выполнена по теме НИР: Биопсихосоциальные механизмы патогенеза и клинического полиморфизма, адаптационный потенциал и предикторы эффективности терапии у больных с психическими и поведенческими расстройствами в регионе Сибири, регистрационный номер 122020200054-8.

The production of antibodies to glutamate receptors (NMDAR) has been found in patients with many neurological and psychiatric disorders. Antibodies against various glutamate receptors, including AMPA-GluR3, NMDA-NR1, NMDA-NR2A/B, mGluR1 or mGluR5, are present in subpopulations of patients with epilepsy, encephalitis, cerebellar ataxia, systemic lupus erythematosus (SLE) and neuropsychiatric SLE, Sjögren's syndrome, schizophrenia, mania or stroke. These autoimmune glutamate receptor antibodies can bind neurons in several areas of the brain, activate glutamate receptors, decrease glutamate receptor expression, impair glutamate-induced signaling and function, activate blood-brain barrier endothelial cells, kill neurons, damage the brain, cause behavioral, psychiatric, or cognitive disorders. But the pathogenetic mechanisms of these phenomena remain unexplored. Studies of the proteolysis of neurospecific proteins by serum antibodies (abzymes) are of high relevance because they could reveal the molecular features of impaired neuroimmune interactions underlying the above diseases. In this work, the catalytic activity of IgG against the recombinant subunits NR1 and NR2 of the NMDA receptor was studied in an in vitro experiment. The recombinant subunit model included peptide fragments from the most functionally active regions of the receptor subunits. For this, two chimeric proteins DBD-NMDAR1 and DBD-NMDAR2 containing fragments of the NR1 and NR2 subunits were constructed based on the pL761 plasmid.

Plasmid pL761 was constructed based on the pR1504 vector containing the nucleotide sequence of the DBD1 dextrans-binding domain from Leuconostoc mesenteroides, a GS-spacer, and a selected nucleotide sequence encoding the NMDAR1 or NMDAR2 glutamate receptor subunit.

Serum IgG from healthy individuals were purified by affinity chromatography on a Protein-G Sepharose column. The belonging of the studied activity directly to IgG was confirmed by electrophoretic homogeneity; highly efficient gel filtration at pH 2.6; determination of "in situ" activity.

The reaction mixture containing 0.5 mg/ml DBD-NMDAR1 or DBD-NMDAR2 proteins and 0.1 mg/ml IgG from healthy individuals was incubated for 9 hours at 37°C. The hydrolysis products of NR1 and NR2 subunits by IgG were evaluated by electrophoresis and chromato-mass-spectrometric analysis on an OrbiTrap Elite mass spectrometer (Thermo Scientific, Germany) connected to an Easy-nLc 1000 nanoflow chromatograph (Thermo Scientific, USA). The results were processed using the Thermo Xcalibur Qual Browser and PEAKS Studio-7.5 software.

Incubation of the recombinant DBD-NMDAR1 and DBD-NMDAR2 proteins with IgG preparations from healthy donors led to a decrease in the intensity of the recombinant protein band on the electropherogram, and hydrolysis of the DBD-NMDAR2 protein was more efficient.

The mass spectrometric analysis data after appropriate processing showed the following results. In the case of hydrolysis of the DBD-NMDAR1 protein, the number of identified peptides (after hydrolysis) from the NR1 domain (mean: 23 peptides) was significantly higher (p=0.005) than from the DBD carrier domain (10 peptides). In the case of DBD-NMDAR2, the number of identified peptides from the NR2 domain (60 peptides) was also significantly higher (p=0.017) than from the DBD carrier domain (45 peptides).

Thus, it was shown for the first time that serum IgG of healthy individuals hydrolyze the NR1 and NR2 subunits of the NMDA receptor in an in vitro experiment, and the hydrolysis of the receptor subunits significantly exceeds the hydrolysis of other parts of the chimera. In this case, the DBD-NMDAR2 protein undergoes more active hydrolysis by antibodies.

Given the high pathogenetic significance of NMDA receptor disruption in mental and neurological disorders, new knowledge about proteolytic abzymes can help identify new molecular mechanisms of disease development.

The work was carried out within the framework of the research topic: Biopsychosocial mechanisms of pathogenesis and clinical polymorphism, adaptive potential and predictors of the effectiveness of therapy in patients with mental and behavioral disorders in the Siberian region, registration number 122020200054-8.