РНК-полимераза 2 (РНКП 2) представляет собой ДНК-зависимую РНК-полимеразу, которая отвечает за транскрипцию матричной РНК (мРНК), большинства малых ядерных РНК (мяРНК) и микроРНК в эукариотических клетках. Транскрипция хроматина РНКП 2 сопровождается сохранением гистоновых белков на ДНК благодаря специфическому механизму транскрипции РНКП 2, сохраняющемуся у эукариотических организмов от дрожжей до человека [1]. Этот процесс сопровождается образованием различных структурных интермедиатов – элонгационных комплексов (ЭК), включающих РНКП 2 и нуклеосому. Пространственные особенности ЭК исследуются с использованием различных экспериментальных подходов, включая электронную микроскопию, крио-ЭМ, ДНК-футпринтинг, методы на основе детекции ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET) и т. д. Подходы на основе FRET с использованием флуоресцентных меток, введенных в нуклеосомную ДНК, позволяют определять структурные особенности ЭК в условиях in vitro, близких к физиологическим.

Нами была изучена структура ЭК, образующегося при непосредственной близости РНКП 2 к нуклеосоме (5 п.н. до ближайшей к промотору границы нуклеосомы, ЭК-5). В исследовании был использован подход, основанный транскрибируемых in vitro флуоресцентно меченых мононуклеосомах, сформированных на высокоаффинной ДНК-последовательности 603 [2, 3]. Позиционированные нуклеосомы представляют собой ориентированный барьер для транскрипции по механизму РНКП 2 [4]. Здесь были использованы 603 нуклеосомы в так называемой «пропускающей» транскрипционной ориентации, поскольку они лучше повторяют свойства нуклеосом, транскрибируемых in vivo [1, 5]. Флуоресцентные метки, составляющие FRET-пару (донор и акцептор), вносили в соседние витки нуклеосомной ДНК. ЭК с РНКП 2 дрожжей собирали с использованием синтетических фрагментов ДНК и РНК-затравки и лигировали к флуоресцентно меченым нуклеосомам.

При транскрипции в присутствии ограниченного набора нуклеозидтрифосфатов были получены ЭК с активным центром фермента в положении -5. ЭК разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях и анализировали методом детекции FRET. Измерения проводились с использованием сканера флуоресценции Amersham Typhoon RGB Imager (Cityva, Швеция). Сравнительный анализ эффективности FRET для свободных нуклеосом и ЭК с РНКП выявил изменения в структуре нуклеосом при приближении к ним РНКП 2. Два типа структур были идентифицированы для ЭК-5 с РНКП 2. Было обнаружено, что ЭК с одинаковой длиной РНК могут находиться в разных конформационных состояниях.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-64-00001). Работа проведена с использованием инфраструктурных возможностей Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского университета «Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология».

Литература:

1. Kulaeva, O. I., Gaykalova, D. A., Pestov, N. A., Golovastov, V. V., Vassylyev, D. G., Artsimovitch, I., and Studitsky, V. M. (2009) Mechanism of chromatin remodeling and recovery during passage of RNA polymerase II, Nature Structural and Molecular Biology, 16, 1272-1278, doi: 10.1038/nsmb.1689.

2. Thåström, A., Lowary, P. T., Widlund, H. R., Cao, H., Kubista, M., and Widom, J. (1999) Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences, Journal of Molecular Biology, 288, 213-229, doi: 10.1006/jmbi.1999.2686.

3. Gerasimova, N.S., Korovina, A.N., Afonin, D.A., Shaytan, K.V., Feofanov, A.V., and Studitsky, V.M. Analysis of Structure of Elongation Complexes in Polyacrylamide Gel with Förster Resonance Energy Transfer Technique, Biophysics, 67(2), 165-170, doi: 10.1134/S0006350922020063.

4. Bondarenko, V. A., Steele, L. M., Ujvári, A., Gaykalova, D. A., Kulaeva, O. I., Polikanov, Y. S., Luse, D. S., and Studitsky, V. M. (2006) Nucleosomes can form a polar barrier to transcript elongation by RNA polymerase II, Molecular Cell, 24, 469-479, doi: 10.1016/j.molcel.2006.09.009.

5. Chang, H.-W., Kulaeva, O. I., Shaytan, A. K., Kibanov, M., Kuznedelov, K., Severinov, K. V., Kirpichnikov, M. P., Clark, D. J., and Studitsky, V. M. (2014) Analysis of the mechanism of nucleosome survival during transcription, Nucleic Acids Research, 42, 1619-1627, doi: 10.1093/nar/gkt1120.

RNA polymerase 2 (Pol 2) is a DNA-dependent RNA polymerase that is responsible for transcription of messenger RNA (mRNA), the majority of small nuclear RNAs (snRNA) and microRNAs in the eukaryotic cells. Moderate transcription through chromatin by Pol 2 is accompanied by survival of the histone proteins on the DNA due to specific Pol 2 type mechanism of elongation conserved from yeasts to human [1]. This process is accompanied by formation of different structural intermediates – elongation complexes (ECs). Spatial features of the ECs are investigated using wide range of experimental approaches including electron microscopy, cryoEM, DNA footprinting, Förster resonance energy transfer (FRET) based techniques etc. FRET-based approaches using fluorescent probes introduced into the nucleosomal DNA allow to determine structural features of the ECs in chromatin in vitro in conditions close to the physiological.

Here we address the structure of EC formed in a close proximity of Pol 2 to the nucleosome (5 bp before the promoter-proximal nucleosomal boundary, EC-5). We used an approach based on the uniquely positioned fluorescently labelled mononucleosomes formed on the high-affinity DNA sequence 603 transcribed in vitro [2, 3]. Positioned nucleosomes present a polar barrier to transcription by Pol 2 type mechanism [4]. Here 603 nucleosomes in permissive transcriptional orientation were used because they better recapitulate the properties of nucleosomes transcribed in vivo [1, 5]. Fluorescent labels were introduced into the adjacent gyres of nucleosomal DNA and reproduced a FRET-pair (donor and acceptor).

Stalled ECs with the enzyme active site in -5 position were obtained during transcription in the presence of a limited set of nucleoside triphosphates. The ECs were divided by electrophoresis in polyacrylamide gel (PAGE) and analyzed using FRET techniques. Measurements were conducted using Amersham Typhoon RGB Imager (Cityva, Sweden) in case of bulk FRET-in-gel. Comparative analysis of FRET efficiency for free nucleosomes and ECs with RNAPs revealed changes in the structure of nucleosomes in ECs. Two types of structures were identified for EC-5. It was found that ECs with the same RNA length could exist in different conformational states.

This work was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 21-64-00001). The study was carried out using equipment of the Interdisciplinary Research and Educational School "Molecular Technologies of Living Systems and Synthetic Biology” of Moscow State University".

References:

1. Kulaeva, O. I., Gaykalova, D. A., Pestov, N. A., Golovastov, V. V., Vassylyev, D. G., Artsimovitch, I., and Studitsky, V. M. (2009) Mechanism of chromatin remodeling and recovery during passage of RNA polymerase II, Nature Structural and Molecular Biology, 16, 1272-1278, doi: 10.1038/nsmb.1689.

2. Thåström, A., Lowary, P. T., Widlund, H. R., Cao, H., Kubista, M., and Widom, J. (1999) Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences, Journal of Molecular Biology, 288, 213-229, doi: 10.1006/jmbi.1999.2686.

3. Gerasimova, N.S., Korovina, A.N., Afonin, D.A., Shaytan, K.V., Feofanov, A.V., and Studitsky, V.M. Analysis of Structure of Elongation Complexes in Polyacrylamide Gel with Förster Resonance Energy Transfer Technique, Biophysics, 67(2), 165-170, doi: 10.1134/S0006350922020063.

4. Bondarenko, V. A., Steele, L. M., Ujvári, A., Gaykalova, D. A., Kulaeva, O. I., Polikanov, Y. S., Luse, D. S., and Studitsky, V. M. (2006) Nucleosomes can form a polar barrier to transcript elongation by RNA polymerase II, Molecular Cell, 24, 469-479, doi: 10.1016/j.molcel.2006.09.009.

5. Chang, H.-W., Kulaeva, O. I., Shaytan, A. K., Kibanov, M., Kuznedelov, K., Severinov, K. V., Kirpichnikov, M. P., Clark, D. J., and Studitsky, V. M. (2014) Analysis of the mechanism of nucleosome survival during transcription, Nucleic Acids Research, 42, 1619-1627, doi: 10.1093/nar/gkt1120.