Создание новых белковых материалов в настоящее время является одним из актуальных направлений биоинженерии. Комбинация природных доменов в гибридном белке может придать ему свойства не присущие каждому из доменов в отдельности. Это даёт широкий простор для творчества в создании белков с новыми свойствами. Мы применили такой подход для олигомерных белков. Основой для гибридных олигомерных белков в наших работах стали Sm-подобные белки. Эти белки удобны тем, что имеют чрезвычайно высокую стабильность. Кроме того, среди них есть олигомеры с разным количеством субъединиц, что даёт возможность выбора под необходимые задачи. Присоединение целевых доменов к олигомерной основе сближает их и определяет взаимную ориентацию усиливая их взаимодействие. С целью определить возможные преимущества и ограничения такой системы нами были спроектированы, получены и исследованы несколько гибридных белков.

Первый гибридный белок, который мы представляем в нашей работе, это комбинация белка Hfq из E.coli и амилоидогенного A-бета пептида 1-40. При получении и исследовании этого белка мы использовали значительную разницу в стабильности структур основы и присоединённых пептидов. Такой подход позволил нам очищать белок в денатурирующих условиях, а затем, ступенчато ренатурируя его, изучить сворачивание каждой из частей этой конструкции. Было показано, что основа сворачивается в ожидаемый олигомер, на котором затем A-бета пептид формирует Тиофлавин Т связывающую структуру. При этом за счёт значительного локального повышения концентрации амилоидогенных пептидов их взаимодействие происходит преимущественно внутри олигомера без образования фибриллярных структур.

Второй гибридный белок, представляемый в этой работе, это комбинация гептамерного Sm-подобного белка из Sulfolobus acidocaldarius (SacSm) и апикального домена белка шаперона GroEL(ADGroEL). В нашей конструкции гиперстабильный SacSm удерживает семь ADGroEL вместе принуждая их к олигомеризации. Для этого белка также была показана ступенчатая сборка и самоорганизация. В первую очередь собирается основа SacSm, а затем на ней сворачиваются ADGroEL. Исследования показали, что гибридный белок обладает термостабильностью выше, чем отдельный ADGroEL и даже выше чем полноразмерный GroEL. Полученный гибридный белок способен связывть ненативные белки, связываемые полноразмерным шапероном GroEL. Также он снижает агрегацию ряда белков при их нагревании, что подтверждает его шаперонную активность.

Полученный нами результат показывает продуктивность создаваемого нами инструмента для стабилизации олигомерных белков. Этот инструмент может быть использован для ряда молекулярно-биологических задач требующих стабилизации кольцевых олигомерных белков.

Работа поддержана грантом РНФ 22-24-00934.

Engineering of new protein materials is currently one of the topical areas of bioengineering. The combination of natural domains in a hybrid protein can give it properties that are not inherent in each of the domains individually. This gives a wide scope for creativity in creating proteins with new properties. We applied this approach to oligomeric proteins. Sm-like proteins became the basis for hybrid oligomeric proteins in our work. These proteins are convenient in that they have an extremely high stability. In addition, among them there are oligomers with a different number of subunits, which makes it possible to choose for the necessary tasks. The addition of target domains to the oligomeric base brings them closer and determines their mutual orientation, enhancing their interaction. In order to determine the possible advantages and limitations of such a system, we have designed, obtained and studied several hybrid proteins.

The first fusion protein we present in our work is the combination of the Hfq protein from E. coli and the amyloidogenic A-beta peptide 1-40. When obtaining and studying this protein, we used a significant difference in the stability of the structures of the base and attached peptides. This approach allowed us to purify the protein under denaturing conditions, and then, stepwise renaturing it, to study the folding of each of the parts of this construct. The Sm-protein base fold into the expected oligomer, on which the A-beta peptide then forms a Thioflavin T binding structure. At the same time, due to a significant local increase in the concentration of amyloidogenic peptides, their interaction occurs mainly within the oligomer without the formation of fibrillar structures.

The second fusion protein presented in this work is the combination of a heptameric Sm-like protein from Sulfolobus acidocaldarius (SacSm) and the apical domain of the GroEL chaperone protein (ADGroEL). In our design, the hyperstable SacSm holds the seven ADGroELs together forcing them to oligomerize. For this protein, stepwise assembly and self-organization was also shown. First of all, the SacSm base is assembled, and then ADGroEL is folded on it. We shown that the fusion protein has a thermal stability higher than the individual ADGroEL and even higher than the full-length GroEL. The resulting fusion protein is capable of binding non-native proteins bound by the full length GroEL chaperone. It also reduces the aggregation of a number of proteins when they are heated, which confirms its chaperone activity.

Our result shows the productivity of our tool for the stabilization of oligomeric proteins. This tool can be used for a number of molecular biological tasks requiring stabilization of circular oligomeric proteins.

This work was supported by the Russian Science Foundation grant 22-24-00934.