Коллаген – основной белок соединительной ткани, состоящий из трех субъединиц в форме альфа-спирали. Трёхмерная структура коллагенов изучается как с использованием биоинформатических подходов, так и с использованием дифракционных методов. Известно более 20 типов коллагенов, при этом у млекопитающих большая часть белков этого семейства приходится на коллаген типа I. Однако вопрос о структурно-функциональной организации коллагенов гидробионтов остаётся открытым. Так, в международной базе данных PDB опубликовано лишь ограниченное число структур молекул коллагена животных и полностью отсутствуют данные о структуре коллагеновых молекул гидробионтов. Поэтому исследование структурно-функциональной организации коллагена гидробионтов вызывает еще более острый научный и прикладной интерес.

Отправной точкой данной работы стала оценка аминокислотного состава дермальных покровов африканского сома (Clarias gariepinus). Наибольшее содержание отмечено для неполярных алифатических аминокислот, а именно для глицина (33.27%), пролина (18.49%) и аланина (10.37%), а наименьшее – для триптофана (0.2%) и тирозина (0.34%), при этом присутствие цистеина не было зафиксировано. В целом, содержание ароматических аминокислот дермальных покровов африканского сома было незначительным, что характерно для тканей, состоящих, преимущественно, из коллагеновых белков.

На следующем этапе был получен раствор белков дермальных покровов африканского сома, имеющий pH5.4, содержащий массовую долю белка – 1.10%, массовую долю жира - 0% и массовую долю углеводов – 0.7%. Входе получения такого раствора произошло перераспределение содержания отдельных аминокислот, в частности, зарегистрировано снижение содержания аргинина с 4.08% до 0.05% и пролина с 18.4% до 0.09%, а присутствие триптофана не было обнаружено. Интересным является тот факт, что в дермальных покровах содержание пролина было одним из самых значимых. Основное отличие в составе аминокислот коллагенов гидробионтов и КРС приходится на аргинин и пролин, содержание которых отличается на несколько порядков.

Если в полученной эмульсии большая часть белков относится к коллагенам, то различия в содержании некоторых аминокислот в образцах, полученных от гидробионтов и от млекопитающих, вполне очевидны ввиду отличий среды обитания. Поэтому была проведена оценка профиля белков, присутствующих в образцах. Эти данные свидетельствуют о том, что в растворе белков дермальных покровов южного сома присутствуют белки, соответствующие молекулярным массам от 120 до 212 кДа и выше. Это указывает на то, что даже в условиях денатурирующего электрофореза значительная часть препарата представляет собой высокомолекулярный белок. Присутствие полос на электрофореграмме, соответствующих по своей подвижности молекулярной массе менее 200 кДа, вызывает сомнения в их принадлежности к коллагенам.

Далее была проведена оценка зарядов беков присутствующих в образцах с использованием электрофоретического фракционирования в нативных условиях от катода к аноду и от анода к катоду. Полученные данные свидетельствуют о том, что все белки эмульсии имеют отрицательный заряд, так как зарегистрированные белковые полосы мигрировали только к положительному полюсу. Для хроматографии была использована слабая анионообменная смола Sephadex DEAEA-25. Было зарегистрировано два максимума, соответствующих 36-ти и 67-мимиллилитрам элюции. Полученные данные свидетельствуют о том, что белки, присутствующие в эмульсии, обладают различным сродством к смоле, при этом интенсивность первого максимума примерно в 4.5 раза выше. Это позволяет провести аналогию с коллагенами млекопитающих, у которых значительная часть коллагенов приходится на коллаген типа I. Результаты электрофоретического фракционирования образцов, полученных в результате хроматографии, свидетельствует о том, что наибольшее содержание белка приходится на 4, 5 и 6 фракцию, молекулярная масса которых составляет свыше 120 кДа, что также свидетельствует в пользу предположения, что данные белки могут относиться к группе коллагенов типа I. Для идентификации белков семейства коллагенов в этих фракциях была проведена обработка коллагеназой из Clostridium histolytica в течение 1, 6 и 24 часов при 37°С. Полученные результаты согласуются с предположением о том, что эти белки относятся к семейству коллагенов. Наиболее интересным является тот факт, что через 1 час инкубации в присутствии коллагеназы, ферментативному гидролизу подвергаются белки, обладающие молекулярной массой в области от 150 до 200 кДа, коллагеновая природа которых ставилась под сомнение. При этом общая тенденция к расщеплению всех белков, присутствующих во всех фракциях, сохраняется. Таким образом, можно сделать заключение о том, что все присутствующие белки, с высокой долей вероятности, относятся к коллагенам.

Совокупная оценка структурно-функциональных свойств белков дает основание считать полученную эмульсию источником функциональных биополимеров, в частности коллагеновых белков. Входе исследований определены: фракционный состав, зарядовое состояние, молекулярная масса, способность к гидролизу под действием коллагеназы C. histolytica. Оценка аминокислотного состава позволяет выявить аналогию и особенности коллагеновых белков животного и рыбного происхождения. Установлено, что в исследуемых эмульсиях присутствуют отрицательно заряженные белки с молекулярной массой свыше 100 кДа, фракции которых содержат преимущественно коллаген. Получены данные, свидетельствующие в пользу предположения о том, что значительная часть коллагенов гидробионтов относится к коллагену типа I, что дает возможность рассматривать их в перспективе как базу для различных субстанций и служить отправной точкой для понимания физико-химической сущности функционирования и оценки возможности применения в технологиях продуктов питания, медицины и косметологии.

Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования России в рамках соглашения N 075-15-2021-1351

Collagen is the main protein of connective tissue, consisting of three subunits in the form of an alpha helix. The three-dimensional structure of collagens is studied using both bioinformatic approaches and diffraction methods. More than 20 types of collagens are known, while in mammals most of the proteins of this family are type I collagen. However, the question of the structural and functional organization of hydrobiont collagens remains open. Thus, only a limited number of structures of animal collagen molecules has been published in the PDB database, and data on the structure of collagen molecules in aquatic organisms are completely absent. Therefore, the study of the structural and functional organization of hydrobiont collagen is of even more acute scientific and applied interest.

The starting point of this work was the assessment of the amino acid composition of the dermal integument of the African catfish (Clarias gariepinus). The highest content was noted for nonpolar aliphatic amino acids, namely, for glycine (33.27%), proline (18.49%), and alanine (10.37%), and the lowest for tryptophan (0.2%) and tyrosine (0.34%), while the presence of cysteine was not was recorded. In general, the content of aromatic amino acids in the dermal integument of the African catfish was insignificant, which is typical for tissues consisting mainly of collagen proteins.

At the next stage, a solution of African catfish dermal integument proteins was obtained, having a pH of 5.4, containing a mass fraction of protein - 1.10%, a mass fraction of fat - 0%, and a mass fraction of carbohydrates - 0.7%. During the preparation of such a solution, the content of individual amino acids was redistributed, in particular, a decrease in the content of arginine from 4.08% to 0.05% and proline from 18.4% to 0.09% was registered, and the presence of tryptophan was not detected. It is interesting that the content of proline in the dermal integument was one of the most significant. The main difference in the amino acid composition of hydrobiont and cattle collagens is arginine and proline, the content of which differs by several orders of magnitude.

If in the resulting emulsion most of the proteins belong to collagens, then the differences in the content of some amino acids in the samples obtained from hydrobionts and from mammals are quite obvious due to differences in the habitat. Therefore, an assessment was made of the profile of the proteins present in the samples. These data indicate that proteins corresponding to molecular masses from 120 to 212 kDa and higher are present in the solution of proteins in the dermal integument of the southern catfish. This indicates that even under conditions of denaturing electrophoresis, a significant part of the drug is a high molecular weight protein. The presence of bands on the electrophoregram, corresponding in their mobility to a molecular weight of less than 200 kDa, raises doubts about their belonging to collagens.

Next, the charges of backs present in the samples were evaluated using electrophoretic fractionation under native conditions from the cathode to the anode and from the anode to the cathode. The data obtained indicate that all proteins of the emulsion have a negative charge, since the registered protein bands migrated only to the positive pole. The weak anion exchange resin Sephadex DEAEA-25 was used for chromatography. Two maxima were recorded, corresponding to 36 and 67 ml of elution. The data obtained indicate that the proteins present in the emulsion have different affinities for the resin, with the intensity of the first maximum approximately 4.5 times higher. This allows us to draw an analogy with mammalian collagens, in which a significant part of collagens is collagen type I. The results of electrophoretic fractionation of samples obtained by chromatography indicate that the highest protein content falls on fractions 4, 5, and 6, the molecular weight of which is over 120 kDa, which also supports the assumption that these proteins may belong to the type I collagen group. To identify proteins of the collagen family, these fractions were treated with collagenase from Clostridium histolytica for 1, 6, and 24 h at 37°C. The results obtained are consistent with the assumption that these proteins belong to the collagen family. The most interesting fact is that after 1 hour of incubation in the presence of collagenase, proteins with a molecular weight in the range from 150 to 200 kDa, the collagen nature of which was questioned, undergo enzymatic hydrolysis. At the same time, the general tendency to cleavage of all proteins present in all fractions is preserved. Thus, it can be concluded that all proteins present, with a high degree of probability, belong to collagens.

The overall assessment of the structural and functional properties of proteins gives grounds to consider the resulting emulsion as a source of functional biopolymers, in particular, collagen proteins. During the research, the following were determined: fractional composition, charge state, molecular weight, ability to hydrolyze under the action of C. histolytica collagenase. Evaluation of the amino acid composition makes it possible to reveal the analogy and features of collagen proteins of animal and fish origin. It has been established that the studied emulsions contain negatively charged proteins with a molecular weight of over 100 kDa, the fractions of which contain predominantly collagen. Data have been obtained that support the assumption that a significant part of hydrobiont collagens belongs to type I collagen, which makes it possible to consider them in the future as a basis for various substances and serve as a starting point for understanding the physicochemical essence of functioning and evaluating the possibility of using them in technologies medicine and cosmetology.

The study was supported by the Ministry of Science and Higher Education of Russia under agreement N 075-15-2021-1351