Каталитически активными антителами, или абзимами, называются иммуноглобулины различных классов, обладающие способностью не только связывать антиген, но и катализировать химические реакции. Показано, что природные IgG, IgA и IgM млекопитающих обладают множеством различных каталитических активностей. Каталитически активные антитела обнаружены как при ряде аутоиммунных и воспалительных заболеваний, так и у здоровых людей. Например, первым примером абзимов у здоровых лиц стали IgA молока человека, катализирующие фосфорилирование белков. Впоследствии были обнаружены липидкиназная и полисахаридкиназная активности этих АТ. У больных с различными аутоиммунными и инфекционными заболеваниями выявлено множество каталитических антител гидролизующих РНК, ДНК, нуклеотиды, липиды, олигопептиды, белки и олигосахариды. Абзимы с оксидоредуктазными активностями начали изучать совсем недавно и пока изучена способность IgG дисмутировать супероксид и гидропероксид водорода. Предполагается, что каталитические антитела с оксидоредуктазными свойствами могут компенсировать дефицит антиоксидантных систем при болезнях и играть важную роль в защите человека от ОС. Генералов с соавторами в 1998 г. показали, что препараты IgG сыворотки крови здоровых доноров и пациентов с различными формами гепатита обладали пероксидазной активностью. В работах А.С. Толмачевой уже в 2015 г. было показано, что IgG, полученные из сыворотки здоровых крыс Wistar, обладают в присутствии H2O2 пероксидазной, а в отсутствие H2O2- оксидоредуктазной активностью. Более пероксидазная активность IgG не исследовалась. Поэтому целью настоящей работы явилось изучение наличия и свойств НАДФН-зависимой пероксидазной активности IgG человека в сравнении с аналогичной каталазной активностью.

В качестве материала исследования использовали сыворотку крови здоровых лиц. Для взятия крови использовались пробирки типа Vacuette с активатором образования сгустка. Для отделения сыворотки пробирку центрифугировали при 2000 g 20 минут в центрифуге с охлаждением.

Методы исследования: Очистка IgG осуществлялась методом аффинной хроматографии на колонках с ProteinG-Sepharose на хроматографе AKTA purifier (GE). Диализ антител проводился против 20 мМ Na-фосфатного буфера, pH=7,0. Концентрацию IgG определяли на многорежимном ридере Varioskan LUX (Thermo Scientific, США) при 280 нм. Гомогенность выделенных препаратов IgG проверялась методом электрофореза по Леммли в градиентном 4-18% ПААГ. Визуализация гелей проводилась с помощью системы iBright Imaging Systems FL1500 (Thermo Scientific, США приборы размещен на базе ЦКП "Медицинская геномика", ТНИМЦ). Гель-фильтрация в условиях pH–шока проводилась на колонке с Superdex-200 HR 10/30 с использованием 50 мМ буфера Gly-HCl, pH 2,6 с предварительной инкубацией IgG с 1 М кислым буфером. НАДФН-зависимую пероксидазную активность Ig G определяли на спектрофотометре SPECORD M-40 (Carl Zeiss) при 340 нм по окислению НАДФН в сопряженной глутатионредуктазной реакции восстановления гидропероксида третичного бутила и выражали в единицах активности U, (U = мкМ НАДФН/мин/мг IgG). Каталазную активность IgG также определяли на спектрофотометре SPECORD M-40 (Carl Zeiss) по снижению концентрации гидроперекиси водорода при добавлении образца. Каталазная активность IgG определялась в единицах активности U, (U=мкМ Н2О2/мин/мг IgG). Ингибиторный анализ проводили с использованием азида натрия (NaN3) и этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), которые являются неспецифическими металлозависимыми ингибиторами. IgG инкубировали с NaN3 в конечных концентрациях от 1 мМ, до 0,005 мМ и определяли НАДФН-зависимую пероксидазная активность IgG. Аналогично работали с ЭДТА в концентрациях от 1,25 Мм до 50 мМ. Для расчета концентрации полумаксимального ингибирования IC50 строился график с помощью онлайн-программы Very Simple IC50 Tool Kit с пакетом GNUPLOT. Статистическая обработка данных проводилась в программе Statistica 12.0.

В результате проведенного исследования можно сделать заключение о том, что иммуноглобулины G здоровых лиц способны катализировать каталазную и пероксидазную реакции, и что данная активность является собственным свойством изучаемых антител. Для проверки принадлежности изучаемой активности к абзимам, использовали три жестких критерия: выделение IgG на специфическом аффинном сорбенте, электрофоретическая гомогенность антител и сохранение исследуемой активности АТ после гельфильтрации в кислой среде. Выявлено, что азид натрия и 3-амино-1,2,4-триазол ингибировали каталазную активность сывороточных IgG, при этом 3-амино-1,2,4-триазол является более эффективным ингибитором каталазной активности IgG (IC50: 16,06 мкМ против 140 мкМ для азида натрия), поскольку требует меньших концентраций для достижения максимального эффекта. Также азид натрия и ЭДТА ингибировали НАДФН-зависимую пероксидазную активность IgG, подтверждая металлозависимость данной активности у иммуноглобулинов, но оказывали эффект в более высоких, милимолярных концентрациях. Была также показана обратная корреляционная связь между данными активностями. Корреляционный анализ каталазной и НАДФН-зависимой пероксидазной активностей IgG выявил сильную отрицательную корреляционная связь (r = -0,85; р=0,001).

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что наибольший вклад в утилизацию гидроперекисей вносят именно антитела с НАДФН-зависимой пероксидазной активностью, а не с каталазной.

Работа выполнена по теме НИР: Биопсихосоциальные механизмы патогенеза и клинического полиморфизма, адаптационный потенциал и предикторы эффективности терапии у больных с психическими и поведенческими расстройствами в регионе Сибири, регистрационный номер 122020200054-8.

Catalytically active antibodies or abzymes are immunoglobulins of various classes that have the ability not only to bind an antigen, but also to catalyze chemical reactions. It is shown that natural mammalian IgG, IgA and IgM have many different catalytic activities. Catalytic antibodies have been found both in a number of autoimmune and inflammatory diseases and in healthy people. For instance, the first example of abzymes in healthy people was human milk IgA, which catalyzes protein phosphorylation. Subsequently, lipid kinase and polysaccharide kinase activities of these antibodies were discovered. Plenty of catalytic antibodies hydrolyzing RNA, DNA, nucleotides, lipids, oligopeptides, proteins and oligosaccharides have been identified in patients with various autoimmune and infectious diseases. Abzymes with oxidoreductase activities began to be researched recently and so far the ability of IgG to dismurg hydrogen superoxide and peroxide is studied. It is assumed that catalytic antibodies with oxidoreductase features can compensate the deficiency of antioxidant systems in diseases and play a significant role in protecting humans from oxidative stress. Generalov with co-authors in 1998 showed that IgG preparations from the blood serum of healthy donors and patients with various forms of hepatitis had peroxidase activity. In the works of A.S. Tolmacheva already in 2015 year it was shown that IgG which are taken from serum of healthy. Wistar rats have peroxidase activity in the presence of hydrogen pyroxide and oxidoreductase activity in the absence of hydrogen pyroxide. More peroxidase activity of IgG has not been researched. Therefore, the purpose of this work was to study the presence and properties of NADPH-dependent peroxidase activity of human IgG in comparison with similar catalase activity.

The blood serum of healthy individuals was used as the material for the study. For blood sampling Vacuette tubes with a clot activator were used. To separate the serum, the tube was centrifuged at 2000 g for 20 minutes in a centrifuge with cooling.

Research methods: Purification of IgG was carried out by affinity chromatography on columns with ProteinG-Sepharose on an AKTA purifier (GE) chromatograph. Antibody dialysis was performed against 20 mM Na-phosphate buffer, pH 7.0. The IgG concentration was determined by a Varioskan LUX multimode reader (Thermo Scientifie, USA) at 280 nm. The homogeneity of isolated IgG preparations was tested by Lemilly electrophoresis in gradient 4-18% PAAG. Gels were visualized with the help of iBright Imaging Systems FL1500 (Thermo Scientine, USA, a device is located in sharing centre “medical genomics”, TNRMC). Gel-filtration in pH-shock conditions was carried out on a Superdex-200 HR 10/30 column using 50 mM Gly-HCl buffer, pH 2.6 with pre-incubation of IgG with 1 M acidic buffer. NADPH-dependent peroxidase activity of IgG was determined on a SPECORD M-40 spectrophotometer (Carl Zeiss) at 340 nm by the oxidation of NADPH in the conjugate glutathione reductase reaction of the reduction of tertiary butyl hydroperoxide and expressed in units of activity U. (U=mkM NADPH/min/mg IgG). The catalase activity of IgG was also determined on a SPECORD M-40 spectrophotometer (Carl Zeiss) by the decrease in the concentration of hydrogen hydroperoxide after adding the sample. Catalase activity of IgG was determined in units of activity U, (U=mkM H2O2 /min/mg IgG). The inhibitory analyse was made with the usage of sodium azide (NaN3) and ethylenediaminetetraacetate (EDTA) which are non-specific metal-dependent inhibitors. IgG were incubated with NaN3 at final concentrations from 1 mM to 0.005 mM and their NADPH-dependent peroxidase activity was determined. Similarly, we worked with EDTA at concentrations from 1.25 mM to 50 mM. To calculate the concentration of half-maximal inhibition IC50, a graph was built using the Very Simple IC50 Tool Kit online program with the GNUPLOT package. Statistical data processing was carried out in the Statistica 12.0 program.

As a result of the study, it can be concluded that immunoglobulins G of healthy donors are able to catalyze catalase and peroxidase reactions and this activity is an own property of the studied antibodies. To check whether the studied activity belongs to abzymes, three strict criteria were used: isolation of IgG on a specific affinity sorbent, electrophoretic homogeneity of antibodies, and retention of the studied AT activity after gel-filtration in an acidic environment. It was found that sodium azide and 3-amino-1,2,4-triazole inhibited the catalase activity of serum IgG, and at the same time 3-amino-1-2-triazole is more effective inhibitor (IC 50 :16,06 mkM against 140 mkM for sodium azide), because it requires lower concentrations to achieve maximum effect. Also, sodium azide and EDTA inhibited NADPH-dependent IgG peroxidase activity, confirming the metal-dependence of this activity in immunoglobulins, but had an effect at higher, millimolar concentrations. An inverse correlation between these activities was also shown in the work. The correlation analyse of catalase and NADPH-dependent IgG peroxidase activities revealed a strong negative correlation (r = -0.85; p=0.001).

Thus, the obtained results suggest that the greatest contribution into the utilization of hydroperoxides is made by antibodies with NADPH-dependent peroxidase activity, and not with catalase.

The study was carried out on the topic of research work: Biopsychosocial mechanisms of pathogenesis and clinical polymorphism, adaptive potential and predictors of the therapy efficiency in patients with mental and behavioral disorders in the Siberian region, registration number 122020200054-8.