VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Молекулярная биофизика. Структура и динамика биополимеров и биомакромолекулярных систем

Изучение структуры вирусоподобных частиц SARS-CoV-2 и ротавируса А человека методами крио-электронной, просвечивающей и аналитической микроскопии

C.А. Черепушкин2, А.В. Моисеенко1, Т.С. Трифонова1, Т.Е. Савочкина2, И.Е. Филатов2, М.Г. Карлова1, Т.В. Гребенникова2, О.С. Соколова1*

1.МГУ, биологический факультет;
2.Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи;

* sokolova184(at)gmail.com

Вирусоподобные частицы (virus-like particles, VLP) – перспективная платформа для разработки и производства вакцин. На сегодняшний день существуют как зарегистрированные вакцины, так широкий спектр вакцин-кандидатов на основе VLP против различных инфекционных агентов. VLP вакцины обладают большей иммуногенностью по сравнению с субъединичными вакцинами и при этом не содержат нуклеиновых кислот вируса, что делает их более безопасными, чем живые и инактивированные вакцины. VLP имитируют структуру вириона и необходимы методы для изучения структуры частиц и подтверждения их подлинности, а также рутинного контроля качества VLP вакцин. Золотым стандартом для решения этих задач являются различные виды электронной микроскопии, в первую очередь просвечивающая электронная микроскопия. Целью настоящей работы была разработка методов электронной микроскопии для изучения структуры вирусоподобных частиц SARS-CoV-2 и ротавируса А человека.

Вирусоподобные частицы SARS-CoV-2 и ротавируса А человека были получены с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых. Культура клеток бабочки Trichoplusia ni заражалась несколькими рекомбинантными бакуловирусами, каждый из которых экспрессировал целевой ген структурного белка вируса. Эти вирусные белки обладают способностью к самосборке с образованием VLP. В состав VLP ротавируса А человека вошли 4 из 6 структурных белков вируса: белки внутреннего слоя VP2 и VP6 и белки внешнего слоя VP4 и VP7. Были получены частицы, состоящие из 2 и из 3 белков: VP2/6, VP2/6-VP7 (генотипы G1, G2, G4, G9) и VP2/6-VP4 (генотипы P4, P8). Также были получены вирусоподобные частицы SARS-CoV-2, состоящие из белков E, M, N и белка S различных штаммов SARS-CoV-2. VLP были очищены методом ультрацентрифугирования в растворе сахарозы и исследованы методами крио-электронной, просвечивающей и аналитической микроскопии.

Образцы исследовали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) в негативном контрасте, а также с помощью анализа единичных частиц в криоэлектронной микроскопии. ПЭМ-изображения были получены на просвечивающем электронном микроскопе JEOL JEM-2100 при ускоряющем напряжении 200 кВ. Для получения изображений в негативном контрасте использовалась CCD камера Gatan Orius SC200D. Для получения серийных изображений криоэлектронной микроскопии на этом же микроскопе был использован криотрансферный держатель Gatan Elsa, детектор прямого обнаружения электронов Direct Electron DE-20 и ПО SerialEM для сбора данных.

Препараты наносили на стандартные медные сеточки для микроскопии с углеродной подложкой, предварительно гидрофилизованную в тлеющем разряде. Образец на сетке инкубировали 60 секунд при комнатной температуре, затем на сетку наносили каплю 2% раствора ацетата уранила, выдерживали 30 секунд, излишки раствора удаляли с сетки фильтровальной бумагой. По результатам просвечивающей электронной микроскопии образцы VLP ротавируса А гомогенны, обусловленный небольшим количеством агрегатов белка. Средний размер VLP (70-80 нм) соответствует размеру полноразмерного вириона, частицы имеют характерную «колесовидную» форму. Образцы VLP SARS-CoV-2 также гомогенны, размер (около 100 нм) соответствует размеру вирусной частицы.

Для подтверждения белкового состава VLP использовали окрашивание антителами, конъюгированными с коллоидным золотом. Сетки с препаратами помещали на каплю блокирующего раствора 0,3% БСА-ФСБТ. После блокировки сетку помещали на каплю раствора первичных антител (10 мкг/мл в растворе 0,3% БСА-ФСБТ), инкубировали 14 ч при +4°С. После инкубации сетку промывали 3 раза по 5 мин на каплях раствора 0,3% БСА-ФСБТ, затем помещали на каплю раствора вторичных антител, конъюгированных с наночастицами золота (Sigma) в разведении 1:250, инкубировали 14 ч при +4°С. VLP ротавируса А окрашивали антителами к белку VP6, а VLP SARS-CoV-2 антителами к рецептор-связывающему домену белка S. Было показано присутствие соответствующих белков в вирусоподобных частицах.

С помощью анализа единичных частиц по данным криоэлектронной микроскопии был произведен статистический анализ проекций вирионов с помощью двумерной классификации, отобран набор из 2500 проекций вирионов. Из этого набора проекций собрана реконструкция VLP ротавируса A с разрешением 7Å по FSC. Обработка произведена в ПО Сryosparc. Реконструкция показала, что расположение белков VP2 и VP6 в VLP аналогично вирусной частице. С помощью аналитической микроскопии было продемонстрировано отсутствие нуклеиновой кислоты в VLP ротавируса A.

Таким образом, структура и морфология вирусоподобных частиц по данным электронной микроскопии соответствуют таковым исходных вирионов.

Исследование выполнено при поддержке Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского государственного университета «Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология».

Study of the structure of SARS-CoV-2 and human rotavirus A virus-like particles by cryo-electron, transmission and analytical microscopy

S. Cherepushkin2, A. Moiseenko1, T. Trifonova1, T. Savochkina2, I. Filatov2, M. Karlova1, T. Grebennikova2, O.S. Sokolova1*

1.Moscow Lomonosov University, Faculty of Biology;
2.The National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya;

* sokolova184(at)gmail.com

Virus-like particles (VLP) are a promising platform for vaccine development and production. To date, there are registered vaccines as well as a wide range of candidate vaccines based on VLP against various infectious agents. VLP vaccines are more immunogenic than subunit vaccines and do not contain virus nucleic acids, making them safer than live and inactivated vaccines. VLPs mimic the virion structure and methods are needed to study the particle structure and confirm their authenticity as well as routine quality control of VLP vaccines. Various types of electron microscopy, primarily transmission electron microscopy, are the gold standard for these tasks. The aim of this work was to develop electron microscopy methods to study the structure of virus-like particles of SARS-CoV-2 and human rotavirus A.

SARS-CoV-2 and human rotavirus A virus-like particles were obtained using a baculovirus expression system in insect cells. A culture of Trichoplusia ni butterfly cells was infected with several recombinant baculoviruses, each expressing the target gene of the structural virus protein. These viral proteins have the ability to self-assemble to form VLPs. The VLP of human rotavirus A included 4 of the 6 structural proteins of the virus: inner layer proteins VP2 and VP6 and outer layer proteins VP4 and VP7. Particles consisting of 2 and 3 proteins were obtained: VP2/6, VP2/6-VP7 (genotypes G1, G2, G4, G9) and VP2/6-VP4 (genotypes P4, P8). SARS-CoV-2 virus-like particles consisting of E, M, N, and S proteins of different SARS-CoV-2 strains were also obtained. The VLPs were purified by ultracentrifugation in sucrose solution and examined by cryo-electron, transmission, and analytical microscopy.

Samples were examined by transmission electron microscopy (TEM) in negative contrast as well as by single particle analysis in cryo-electron microscopy. PEM images were obtained on a JEOL JEM-2100 transmission electron microscope at an accelerating voltage of 200 kV. A Gatan Orius SC200D CCD camera was used to acquire images in negative contrast. A Gatan Elsa cryotransfer holder, a Direct Electron DE-20 direct electron detection detector, and SerialEM data acquisition software were used to obtain serial cryo-electron microscopy images on the same microscope.

The preparations were applied to standard copper microscopy grids with a carbon substrate prehydrophilized in a glow discharge. The sample on the grid was incubated for 60 seconds at room temperature, then a drop of 2% uranyl acetate solution was applied to the grid, incubated for 30 seconds, and the excess of the solution was removed from the grid with filter paper. According to the results of transmission electron microscopy, the VLP samples of rotavirus A are homogeneous due to a small amount of protein aggregates. The average VLP size (70-80 nm) corresponds to the size of a full-length virion, and the particles have a characteristic "wheel-like" shape. The VLP samples of SARS-CoV-2 are also homogeneous, the size (about 100 nm) corresponding to the size of the viral particle.

Staining with antibodies conjugated with colloidal gold was used to confirm the protein composition of VLP. The nets with the preparations were placed on a drop of 0.3% BSA-FSBT blocking solution. After blocking, the grid was placed on a drop of primary antibody solution (10 µg/ml in 0.3% BSA-FSBT solution) and incubated for 14 h at +4°C. After incubation, the grid was washed 3 times 5 min each on drops of 0.3% BSA-FSBT solution, then placed on a drop of a solution of secondary antibodies conjugated with gold nanoparticles (Sigma) at a dilution of 1:250, incubated for 14 h at +4°C. VLP of rotavirus A was stained with antibodies to the VP6 protein and VLP of SARS-CoV-2 with antibodies to the receptor-binding domain of protein S. The presence of these proteins in virus-like particles was shown.

A statistical analysis of virion projections using two-dimensional classification was performed using single particle analysis by cryo-electron microscopy data, and a set of 2500 virion projections was selected. From this set of projections, a VLP reconstruction of rotavirus A was assembled at 7 Å FSC resolution. The processing was done in the Curacris software. The reconstruction showed that the arrangement of the VP2 and VP6 proteins in the VLP was similar to that of the viral particle. Analytical microscopy demonstrated the absence of nucleic acid in the VLP of rotavirus A.

Thus, the structure and morphology of virus-like particles according to electron microscopy data correspond to those of the original virions.

This research has been supported by the Interdisciplinary Scientific and Educational School of Moscow Lomonosov University «Molecular Technologies of the Living Systems and Synthetic Biology».


Докладчик: Соколова О.С.
132
2023-02-15

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists