На долю β-лактамных антибиотиков приходится 70% всех лекарственных средств. Для β-лактамных антибиотиков превалирующими механизмами устойчивости являются модификация пенициллин связывающих белков и инактивация антибиотиков бактериальными ферментами β лактамазами. Оба эти процесса на примере реакции ингибирования пеницилин-связывающего белка 2 (ПСБ2) из Neisseria Gonorrhoeae антибиотиком цефтриаксоном и реакции инактивации антибиотика имипенема металло- β-лактамазами L1 и NDM 1 были рассмотрены методами молекулярного моделирования. Комбинированными методами квантовой механики/молекулярной механики описан эффект активации субстрата ферментом, установлены молекулярные механизмы реакций в активных центрах этих ферментов, а методами классической молекулярной динамики проанализированы конформационные перестройки в структурах исследуемых объектов.

Пенициллин-связывающие белки 2 из Neisseria Gonorrhoeae являются критически важными ферментами в формировании клеточной стенки бактерий. Ингибирование ПСБ2 используется при лечении различных заболеваний, включая гонорею. Цефтриаксон — единственный препарат, используемый в настоящее время для лечения гонореи, он встраивается в активный центр ПСБ2 вместо природного субстрата, необратимо ингибируя таким образом действие фермента. Однако известны случаи резистентности ПСБ2 к этому антибиотику. Известны дикий штамм FA19, не проявляющий устойчивость к пенициллину, и штаммы 35/02 и H041, обладающие рядом мутаций, которые позволяют им проявлять устойчивость к действию антибиотиков. Экспериментальные данные по константам эффективности (k2/Ks) демонстрируют, что эффективность ингибирования падает в 150 раз и 2300 раз для 35/02 и H041, соответственно. Для FA19 из литературы известны индивидуальные параметры (k2 и Ks), но для мутантных форм определить их экспериментально не представляется возможным. Деацилирование происходит медленно, поэтому считается, что реакция происходит необратимо. Таким образом, рост резистентности с точки зрения молекулярного механизма связан либо со снижением сродства ПСБ2 к цефтриаксону, либо со снижением скорости ацилирования.

Молекулярное моделирование механизма реакции ингибирования ПСБ2 из данных штаммов цефтриаксоном показало, что изменение положение субстрата в активном центре фермента ввиду мутации G545S отражается в формировании оксианионного центра и, как следствие, высоте энергетического барьера первой стадии реакции. Анализ молекулярно-динамических траекторий фермент-субстратных комплексов, в частности электронно-плотностными дескрипторами, позволил идентифицировать набор структур как реакционные и нереакционные. Показано, что доля реакционных структур падает с ростом резистентности. Просканирована поверхность свободной энергии Гиббса, определены элементарные стадии реакции. Установлено, что механизм реакции в мутантных ПСБ2 и из штамма дикого типа отличаются: разрыв связи C–N и отрыв фрагмента антибиотика происходит последовательно в белке из штамма дикого типа и одновременно в мутантных белках. Новое положение субстрата в каталитическом кармане также влечет за собой изменения сродства к антибиотику. Анализируя конформационные изменения петли β3-β4, показано, что с ростом резистентности сродство ПСБ2 к цефтриаксону понижается.

Превалирующим механизмом инактивации β-лактамных антибиотиков является экспрессия бактериальных ферментов β-лактамаз. Известно, что реакция инициируется нуклеофильной атакой каталитического гидроксид-аниона, что в дальнейшем приводит к разрыву β-лактамного кольца и образованию отрицательно заряженного интермедиата реакции. В этом интермедиате заряд делокализован между тремя атомами пирролинового кольца имипенема – NC2C3-. Затем происходит протонирование интермедиата, однако на какой атом, N или С3, неизвестно. Экспериментальные данные демонстрируют, что конечным продуктом реакции для обоих ферментов является протонированный по углероду R-изомер имипенема ((R)-имин). Однако неясно: образуется ли (R)-имин в активном центре ферментов или же в результате таутомеризации из N-продукта импенема (енамина) в растворе.

В ходе работы изучены особенности строения фермент-субстратных комплексов L1 и NDM-1. Значимой структурной особенностью является разный аминокислотный состав петли 10, накрывающей активный центр в обоих ферментах. В L1 над активным центром находится гидрофобный жесткий аминокислотный остаток Pro226, что делает положение субстрата в активном центре структурно более жестким, малоподвижным. В NDM-1 над субстратом находится гибкий Gly219, вследствие чего активный центр NDM 1 более подвижен. Эти особенности строения обуславливают разницу в активации имипенема и ходе реакции.

Анализ молекулярно-динамических траекторий фермент-субстратных комплексов показал, что формирование более жесткого активного центра в L1 приводит к более эффективной активации субстрата ферментом, и как следствие, более низкому энергетическому барьеру и большей стабилизации интермедиата первой стадии реакции.

Сканированием поверхности потенциальной энергии установлен механизм реакции гидролиза имипенема данными ферментами. Енамин образуется как основной продукт в активном центре NDM-1 и как единственный продукт в активном центре L1. В NDM-1 за счет большей подвижности петли 10 в активный центр попадает вода, что определяет существование альтернативного пути реакции, который приводит к образованию (S)-имина. Этот процесс происходит с более высокими энергетическими барьерами.

Исследовано поведение продуктов ферментативной реакции в растворе. Применено моделирование классической молекулярной динамики енамина и отрицательно заряженного интермедиата реакции. Анализ полученных конформаций по ключевым геометрическим критериям показал, что более вероятна таутомеризация емина в (R)-имин. Полученные результаты согласуются с известными экспериментальными данными.

The dominant mechanisms of resistance for β-lactam antibiotics are modification of penicillin-binding proteins and inactivation of antibiotics by bacterial enzymes called β-lactamases. Molecular modeling has been used to study these processes, including examples such as the inhibition of penicillin-binding protein 2 by ceftriaxone and the inactivation of imipenem by metallo-β-lactamases L1 and NDM-1. Substrate activation effects and molecular mechanisms of reactions were described using combined quantum mechanics/molecular mechanics methods, while classical molecular dynamics methods were used to analyze conformational rearrangements in the investigated structures.

Penicillin-binding proteins 2 from Neisseria Gonorrhoeae are critically important enzymes in the formation of bacterial cell walls. Inhibition of PBPs is used in the treatment of various diseases, including gonorrhea. Ceftriaxone is the only drug currently used to treat gonorrhea, as it irreversibly inhibits the action of the enzyme by incorporating into the active site of PBP2 instead of the natural substrate. The cases of PBPs resistance to this antibiotic are known: wild-type strain FA19 showing no resistance to penicillin, and mutant strains 35/02 and H041 are resistant. Experimental data of secondary acylation constants (k2/Ks) demonstrate that the inhibition efficiency decreases by 150 and 2300 times for 35/02 and H041, respectively. The acylation constant and binding constant are known for FA19, but it is not possible to determine them experimentally for mutant forms. Due to slow deacylation the reaction is considered irreversible. Thus, the growth of resistance is associated with a decrease in either the affinity of PBP2 for ceftriaxone or the rate of acylation.

Molecular modeling of the mechanism of PBP2 inhibition in these strains by ceftriaxone revealed that the G545S mutation in the active sites of mutant strains affects the substrate position. This change affects the formation of the oxyanion hole and the height of the activation energy barrier. Electron density based analysis of the set of enzyme-substrate complexes allowed identification of a set of reactive and non-reactive structures. It was shown that the proportion of reactive structures decreases with increasing resistance. The molecular mechanism of the reaction was established by the scanning of Gibbs free energy surface. The reaction mechanism in the mutant PBP2 and the wild-type strain is different: the C-N bond cleavage and the detachment of the antibiotic fragment occur sequentially in the wild-type strain protein and simultaneously in mutant proteins. The new position of the substrate in the catalytic pocket also leads to changes in the affinity to the antibiotic. Analyzing conformational changes in the β3-β4 loop, it was shown that with increasing resistance, the affinity of PBP2 to ceftriaxone decreases.

The main mechanism for inactivating β-lactam antibiotics is the expression of bacterial β-lactamase enzymes. It is known that the reaction is initiated by a nucleophilic attack of a catalytic hydroxide anion. Then the β-lactam ring is broken and a negatively charged reaction intermediate is formed. In this intermediate, the charge is delocalized between three atoms of the pyrroline ring of imipenem - NC2C3-. The intermediate is then protonated, but it is unknown which atom, N or C3, is protonated. Experimental data demonstrate that the final product of the reaction for both enzymes is the carbon-protonated R-isomer of imipenem ((R)-imine). However, it is unclear whether (R)-imine is formed in the active site of the enzymes or through tautomerization from the N-product of imipenem (enamine) in solution.

The study investigated the structural features of the enzyme-substrate complexes L1 and NDM-1. The different amino acid composition of loop 10 is a significant structural feature. Loop 10 covers the active site in both enzymes. In L1, there is a hydrophobic, rigid amino acid residue Pro226 above the active site, making the position of the substrate in the active site more structurally rigid and immobile. In NDM-1, flexible Gly219 is located above the substrate, which makes the NDM 1 active site more mobile. These structural features account for the difference in the activation of imipenem and the reaction mechanism.

The analysis of molecular dynamics trajectories of enzyme-substrate complexes showed that the formation of a more rigid active site in L1 leads to more efficient activation of the substrate by the enzyme. As a result, this leads to a lower energy barrier and greater stabilization of the intermediate of the first stage of the reaction.

The molecular mechanism of reaction was established by scanning the potential energy surface. Enamine is formed as the main product in the active site of NDM-1 and as the only product for L1. Molecule of water enters the active site of NDM-1 due to the greater mobility of loop 10. This determines the existence of an alternative reaction pathway leading to the formation of (S)-imine. This process occurs with higher energy barriers.

The behavior of the products of the enzymatic reaction in solution has been studied. Classical molecular dynamics simulations of the enamine and the negatively charged reaction intermediate were used. Analysis of the obtained conformations based on key geometric criteria showed that tautomerization of the enamine to (R)-imine is more probable. The obtained results are consistent with known experimental data.