Гибель клеток, связанная с митохондриальной дисфункцией, часто встречается при острых неврологических расстройствах, нейродегенеративных заболеваниях, гипоксиях и ишемии. Апоптоз нейронов регулируется множеством белков, включая нейроглобин (Ngb), небольшой гемсодержащий белок из семейства глобинов. Ngb обнаружен в высокой концентрации в нейронах, причем его суперэкспрессия способствует выживанию нейронов, таким образом, уменьшая повреждения мозга, как при инсульте, так и при болезни Альцгеймера in vivo. Одна из наиболее популярных гипотез осуществления нейропротекторной функции Ngb основана на взаимодействии Ngb с митохондриальным цитохромом с (Cyt с), в результате которого предотвращается запуск апоптоза по Cyt с-зависимому пути. Однако молекулярные основы механизма взаимодействия Ngb и Cyt с до сих пор не изучены, характер их взаимодействия не установлен. В связи с этим представляется актуальным исследование механизмов взаимодействия Ngb с Cyt с, понимание которых позволит перейти к рациональному дизайну новых терапевтических средств для ингибирования гибели нейрональных клеток в условиях ишемии и гипоксий различного генеза.

Нами была разработана эффективная система продукции рекомбинантного человеческого Ngb в виде функционально-активной холоформы: сконструирован плазмидный вектор pET-17b-Ngb с геном Ngb, получен бактериальный штамм-продуцент E. coli SHuffleT7-Ngb, разработана и оптимизирована схема биосинтеза, выделения из клеток-продуцентов и очистки рекомбинантного Ngb. При помощи спектральных методов анализа получены физико-химические характеристики рекомбинантного Ngb: согласно данным УФ-видимой, ИК-, КД- и ЯМР-спектроскопий рекомбинантный Ngb представляет собой структурированную холоформу белка. Данные хромато-масс-спектрометрического анализа позволили сделать вывод о наличии в структуре окисленной формы Ngb правильно замкнутой дисульфидной связи.

При помощи спектроскопии комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния (КР) с лазерным возбуждением 532 нм показано, что характерные спектры гема Ngb в восстановленной (Fe2+) и окисленной (Fe3+) формах обладают полосами, соответствующими гему B-типа, а атом железа является гексакоординированным. С использованием спектроскопии КР с лазерным возбуждением 633 нм установлено, что в Ngb(Fe2+) остатки цистеинов белковой части находятся в свободном состоянии, в то время, как в Ngb(Fe3+) они образуют дисульфидную связь. Также были выявлены отличия в колебании С-N связей в белковой части восстановленного и окисленного Ngb, что может быть связано с изменением взаимного расположения α-спиралей при переходе Ngb между редокс-формами.

Мы показали, что спектры КР Cyt с(Fe2+) обладают характерными пиками в области 500-700 см-1 и 1313 см-1, отсутствующими на спектрах КР Ngb(Fe2+), при этом спектры Ngb отличаются наличием пиков 1306 и 1342 см-1. Указанные спектральные особенности позволили определять эти белки при регистрации спектра их смеси.

При помощи спектроскопии КР была разработана методика для регистрации конформационных и редокс-изменений белков, сопровождающих окислительно-восстановительную (ОВ) реакцию между Ngb(Fe2+) и Cyt с(Fe3+). Чтобы исключить влияние избытка восстановителя на вносимый Cyt с(Fe3+) мы получали разностные спектры вычитанием из спектра смеси (1): Ngb(Fe2+)+Cyt с(Fe3+) спектр смеси (2): Ngb(Fe2+)+буфер+Cyt с(Fe3+). Так как в смеси (2) происходило реокисление Ngb(Fe2+), восстановление вносимого Cyt с(Fe3+) возможно за счет избытка восстановителя в растворе. Таким образом, полосы разностных спектров показывают эффекты, вызываемые ОВ-реакцией между гемами.

На разностных спектрах интенсивны пики в области 600-700 см-1, связанные с колебаниями C-S связей между гемом и остатками Cys14 и Cys17 Cyt с. Интенсивный пик в области 1330 см-1 характерен для гемов С-типа. Также наблюдали пики в области 1140 см-1 (колебания метильных радикалов) и 1570-1610 см-1, связанные с колебаниями метиновых мостиков. Можно предположить, что наблюдаемые изменения связаны с подстройкой гема Cyt с в гемовой впадине для ОВ-взаимодействия с гемом Ngb. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что между Ngb(Fe2+) и Cyt c(Fe3+) происходил перенос электрона.

Кроме того, был проведен сравнительный анализ одномерного 1H-ЯМР-спектра эквимолярной смеси Ngb/Cyt с и суммы 1H-ЯМР-спектров Ngb и Cyt с, накопленных по отдельности. Был выявлен сдвиг ряда 1H-ЯМР-сигналов в смеси белков, что указывает на то, что рекомбинантные белки Ngb и Cyt с образуют комплекс при смешивании в растворе.

На основе литературных данных были сконструированы и получены панели вариантов Ngb (с мутациями E60K, E87K, K67E и K95E) и Cyt с (с мутациями K25E, K72E и K25E/K72E) с заменами остатков в предполагаемом интерфейсе взаимодействия этих белков. Эти варианты мутаций предполагают изменение заряда аминокислотного остатка на противоположный, и, следовательно, способны влиять на электростатические взаимодействия между белковыми молекулами.

С помощью описанной выше методики были исследованы конформационные и редокс-изменения гемопорфиринов, сопровождающие ОВ-взаимодействие мутантных форм Ngb с диким типом Cyt с и наоборот. Показано, что взаимодействие NgbK67E, NgbE60K, NgbE87K с диким типом Cyt с сопровождается ОВ-реакцией с переносом электрона, при этом взаимодействие NgbK95E с диким типом Cyt с, вероятно, нарушено, и восстановление Cyt с происходит только за счёт избытка восстановителя в растворе. Также сделано предположение, что взаимодействие Cyt сK25E с диким типом Ngb ослаблено, тогда как для взаимодействия между Cyt сK72E и Ngb дикого типа такого ослабления выявлено не было.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 22-24-00985).

Cell death associated with mitochondrial dysfunction is common in acute neurological disorders, neurodegenerative diseases, hypoxia, and ischemia. Neuronal apoptosis is regulated by a variety of proteins, including neuroglobin (Ngb), a small heme-containing protein from the globin family. Ngb is found in high concentration in neurons and its overexpression promotes neuronal survival, thus reducing brain damage in both stroke and Alzheimer's disease in vivo. One of the most popular hypotheses for the implementation of the neuroprotective function of Ngb is based on the interaction of Ngb with mitochondrial cytochrome c (Cyt с), which prevents the initiation of apoptosis by the Cyt с. However, the molecular basis of the mechanism of interaction between Ngb and Cyt с has not yet been studied, and the nature of their interaction has not been established. In this regard, it seems relevant to study the mechanisms of interaction between Ngb and Cyt с, the understanding of which will allow us to proceed to the rational design of new therapeutic agents for inhibiting the neuronal cells' death under conditions of ischemia and hypoxia of various origins.

We have developed an effective system for the production of recombinant human Ngb in its functionally active holoform: a plasmid vector pET-17b-Ngb with the Ngb gene has been constructed, a bacterial strain of E. coli SHuffleT7-Ngb has been obtained, system for the biosynthesis, isolation and purification of recombinant Ngb has been developed and optimized. Using spectral methods of analysis, the physicochemical characteristics of recombinant Ngb were obtained: according to UV-visible, IR, CD, and NMR spectroscopy, recombinant Ngb is a structured protein in the holoform state. The data of chromato-mass-spectrometric analysis allowed us to conclude that the structure of the oxidized form of Ngb contains a correctly formed disulfide bond.

Using Raman and surface-enhanced Raman spectroscopy (RS) with laser excitation at 532 nm, it was shown that the characteristic spectra of Ngb heme in the reduced (Fe2+) and oxidized (Fe3+) forms have bands corresponding to B-type heme, and the iron atom is six-coordinated. Using RS with laser excitation at 633 nm, it was found that in Ngb(Fe2+) the cysteine residues of the protein part are in a free state, while in Ngb(Fe3+) they form a disulfide bond. Differences in the vibration of C-N bonds in the protein part of reduced and oxidized Ngb were also detected, which may be associated with a change in the mutual arrangement of α-helices during the transition of Ngb between redox forms.

We have shown that the Raman spectra of Cyt с(Fe2+) have characteristic peaks in the region of 500-700 cm-1 and 1313 cm-1, which are absent in the Raman spectra of Ngb(Fe2+), while the spectra of Ngb differ in the presence of peaks at 1306 and 1342 cm-1. These spectral features made it possible to determine these proteins when recording the spectrum of their mixture.

RS was used to develop a technique for recording conformational and redox changes in proteins accompanying the redox (RO) reaction between Ngb(Fe2+) and Cyt с(Fe3+). To eliminate the influence of excess reducing agent on the introduced Cyt с(Fe3+), we obtained difference spectra by subtracting from the spectrum of mixture (1): Ngb(Fe2+)+Cyt с(Fe3+) spectrum of mixture (2): Ngb(Fe2+)+buffer+Cyt с(Fe3+). Since the reoxidation of Ngb(Fe2+) occurred in mixture (2), the reduction of the introduced Cyt с(Fe3+) is possible due to the excess of the reducing agent in the solution. Thus, the bands of the difference spectra show the effects caused by the RO-reaction between hemes.

The difference spectra show intense peaks in the region of 600-700 cm-1 associated with vibrations of C-S bonds between the heme and Cys14 and Cys17 Cyt с residues. An intense peak at 1330 cm-1 is characteristic of C-type hemes. Peaks were also observed in the region of 1140 cm-1 (vibrations of methyl radicals) and 1570-1610 cm-1 associated with vibrations of methine bridges. It can be assumed that the observed changes are associated with the adjustment of the heme Cyt с in the heme cavity for RO-interaction with the Ngb heme. Thus, the results obtained indicate that an electron transfer occurred between Ngb(Fe2+) and Cyt с(Fe3+).

In addition, a comparative analysis of the one-dimensional 1H-NMR spectrum of an equimolar mixture of Ngb/Cyt с and the sum of the 1H-NMR spectra of Ngb and Cyt с accumulated separately was carried out. A shift in the number of 1H-NMR signals in the protein mixture was detected, indicating that the recombinant Ngb and Cyt с proteins form a complex when mixed in solution.

Based on the literature data, panels of Ngb(with E60K, E87K, K67E, and K95E mutations) and Cyt c (with K25E, K72E, and K25E/K72E mutations) mutants were constructed and obtained with substitutions of residues in the putative interaction interface of these proteins. These mutations are able to influence electrostatic interactions between proteins due to a change in the charge of the amino acid residue to the opposite.

The method described above was used to study the conformational and redox changes in hemoporphyrins accompanying the RO-interaction of Ngb mutants with wild-type Cyt с and vice versa. It has been shown that the interaction of NgbK67E, NgbE60K, NgbE87K with wild-type Cyt с is accompanied by an RO-reaction with electron transfer, while the interaction of NgbK95E with wild-type Cyt с is probably disturbed, and reduction of Cyt с occurs only due to an excess of reducing agent in solution. It was also suggested that the interaction of Cyt сK25E with wild-type Ngb is attenuated, while no such attenuation was found for the interaction between Cyt сK72E and wild-type Ngb.

The study is supported by Russian Science Foundation (project № 22-24-00985).