Эндопептидазы IdeS и IdeZ синтезируются патогенными стрептококками Streptococcus pyogenes и S. zooepidemicus обладают исключительной субстратной специфичностью. Эти цистеиновые протеазы расщепляют тяжелые цепи IgG в единственном месте в шарнирной области в два этапа: сначала расщепление одной из двух тяжелых цепей с образованием расщепленной в одном месте молекулы (scIgG), сохраняющей одну из тяжелых цепей интактной. Молекула scIgG менее чувствительна к расщеплению, чем целая молекула IgG, и расщепление молекулы scIgG с образованием F(ab’)2 и Fc происходит в 100 раз медленнее, чем нативной молекулы IgG. Исключительно высокая субстратная специфичность послужила основой применения IdeS и IdeZ в качестве биофармацевтического средства для временного удаления патогенных IgG при аутоиммунных состояниях человека и предотвращения реакции отторжения у сенсибилизированных больных после трансплантации почки (IdeS), а также в качестве антигена субъединичной ветеринарной вакцины от стрептококковой инфекции (IdeZ). По данным литературы, использование гидролиза IdeS упрощает процедуру расшифровки аминокислотной последовательности моноклональных антител. Гены ideS и ideZ клонированы (в случае ideS ген клонирован из коллекционного штамма, в случае ideZ ген синтетический) и экспрессированы в системе гетерологичной экспрессии в Escherichia coli. В аминокислотную последовательность каждой эндопептидазы введен аффинный домен 6-His-tag. Ферменты IdeS и IdeZ выделены и очищены металл-аффинной хроматографией. Идентичность первичной структуры полученных рекомбинантных IdeS и IdeZ природным ферментам подтверждена масс-спектрометрией. Полученные IdeS и IdeZ гомогенны при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПАГ) и активны в отношении IgG человека и различных видов животных. Специфичность расщепления иммуноглобулинов IgG человека эндопептидазами IdeS и IdeZ подтверждена методом электрофореза в ПАГ и масс-спектрометрией. В нашей работе продемонстрировано преимущество применения гидролиза рекомбинантными IdeS и IdeZ в дополнение к стандартно применяемому набору протеаз при определении структуры (аминокислотной последовательности) моноклонального антитела - иммуноглобулина человека – посредством масс-спектрометрического анализа (фингерпринтинга). Также впервые разработана система твердофазного иммуноферментного анализа и продемонстрировано применение рекомбинантной IdeZ для диагностики и определения титра специфических антител в крови лошадей, контактировавших с патогенным стрептококком и переболевших мытом. Применение рекомбинантных IdeS и IdeZ перспективно с точки зрения биотехнологии, а также медицины и ветеринарии.

IdeS and IdeZ endopeptidases are secreted by pathogenic Streptococcus pyogenes and S. zooepidemicus, respectively, and possess exceptional substrate specificity. These cysteine proteases cleave IgG heavy chains at a single site in the hinge region in two steps: first cleaving one of the two heavy chains to form a single cleaved IgG molecule (scIgG) keeping intact one of the heavy chains. The scIgG molecule is less susceptible to cleavage than the whole IgG molecule, and the cleavage of the scIgG molecule to F(ab')2 and Fc is 100 times slower than that of the native IgG molecule. The exceptionally high substrate specificity has served to the usage of IdeS and IdeZ as biopharmaceutical agents for the temporary removal of pathogenic IgG in human autoimmune conditions and the prevention of rejection in sensitized patients after kidney transplantation (IdeS), and as a constituent antigen comprising subunit veterinary vaccine against streptococcal infection (IdeZ). According to the literature, the use of IdeS hydrolysis simplifies the procedure for deciphering the amino acid sequence of monoclonal antibodies. The ideS and ideZ genes are cloned (in the case of ideS, the gene is cloned from a collection strain; in the case of ideZ, the gene is synthetic) and expressed in a heterologous expression system in Escherichia coli. The 6-His-tag affinity domain was introduced into the amino acid sequence of each endopeptidase. The enzymes IdeS and IdeZ are isolated and purified by metal affinity chromatography. The identity of the primary structure of the obtained recombinant IdeS and IdeZ to natural enzymes is confirmed by mass spectrometry. The produced recombinant IdeS and IdeZ are homogeneous on polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and are active against human and various animal IgG. The specificity of the human IgG cleavage by endopeptidases IdeS and IdeZ is confirmed by PAG electrophoresis and mass spectrometry. We have demonstrated the advantage of using hydrolysis with recombinant IdeS and IdeZ in addition to the standard set of proteases in determining the structure (amino acid sequence) of a monoclonal antibody - human immunoglobulin – using peptide mass fingerprinting. Also, for the first time, a system of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed, and the use of recombinant IdeZ was demonstrated for diagnosing and determining the titer of specific antibodies in the blood of horses that had contact with pathogenic streptococci and recovered from Horse Strangles. The use of recombinant IdeS and IdeZ is promising from biotechnological, medical, and veterinary points of view.