Хроматин представляет собой сложную высоко динамичную систему, которая включает в себя множество факторов. Длина ДНК в хромосоме значительно превышает размер ядра эукариотической клетки и вопрос упаковки ДНК очень важен в биологии не только со структурной точки зрения, но и потому что он тесно связан с правильным функционированием всего генетического аппарата клетки. Высокая степень компактизации ДНК в ядре достигается за счет ее взаимодействия с разнообразными гистоновыми и негистоновыми белками. Гистоны (Н2А, Н2В, Н3 и Н4) образуют белковую частицу вокруг, которой закручена ДНК. Эти частицы соединены линкерным участком ДНК, с которым взаимодействует пятый гистон Н1. С этим же участком связаны белки большого семейства негистоновых белков – белки с высокой электрофоретической подвижностью (High Mobility Group). Среди таких белков наиболее интересными с нашей точки зрения являются белки HmgB1 и HmgB2, которые активно участвуют не только в регуляции структуры хроматина, но и принимают непосредственное участие во многих клеточных процессах, таких как транскрипция, репарация, рекомбинация. Кроме того, в составе многих транскрипционных факторов в качестве ДНК-связывающих элементов были обнаружены домены, гомологичные домену белка HmgB1. Белки HmgB1 и HmgB2 не обладают специфичностью при взаимодействии с ДНК. Однако также как и гистон Н1 они способны узнавать и связываться с участками ДНК с различными структурными нарушениями. Интересным является и тот факт, что при определенных условиях (в следствие посттрансляционных модификаций или изменения окислительно-восстановительного статуса) HmgB1 покидает ядро, перемещается в цитоплазму, а затем выходит во внеклеточное пространство. Все эти процессы тесно связаны с развитием различных заболеваний человека, начиная от сердечных патологий и кончая нарушениями в развитии плода. При выходе HMGB1 из ядра его количество в ядре уменьшается, а белок HmgB2 продолжает функционировать в нормальном режиме. В связи с вышесказанным важно понимать тонкие структурные различия белков HmgB1 и HmgB2, что, несомненно, влияет на механизмы их взаимодействия с ДНК и другими партнерами.

Белки HmgB1 и HmgB2 весьма близки по своей структуре и аминокислотной последовательности. Оба состоят из короткого N-концевого участка, двух ДНК-связывающих доменов А и В, соединенных линкером, и неупорядоченной С-концевой последовательности из остатков глютаминовой и аспарагиновой аминокислот. Наиболее распространенным методом исследования вторичной структуры белков является круговой дихроизм в УФ-диапазоне. Этот метод позволяет отслеживать изменения структуры как самих белков, так и их комплексов с ДНК.

В работе методами кругового дихроизма (КД) и УФ спектроскопии изучали вторичную структуру белков HmgB1 и HmgB2 тимуса теленка, а также особенности их взаимодействия с ДНК. Кроме того, с помощью метода масс-спектрометрии проведен сравнительный анализ пост-трансляционных модификаций (ПТМ) белков HmgB1 и HmgB2.

В работе показано, что характер расположения ПТМ в исследованных белках различен. В то время как ПТМ HmgB1 расположены преимущественно в А ДНК-связывающем домене и на линкерном участке между А и В доменами, ПТМ HmgB2 сосредоточены в его В домене и также в области линкерного участка. Показано, что, несмотря на высокую степень гомологии между HmgB1 и HmgB2, вторичная структура этих белков различна. Анализ спектров КД белков показал, что в физиологических условиях белок HmgB1 характеризуется более упорядоченной вторичной структурой, чем HmgB2. В то же время HmgB2 проявляет большую конформационную гибкость при изменении внешних условий. Мы полагаем, что такая гибкость способствует структурной адаптации белка HmgB2 в гораздо большей степени, чем для белка HmgB1. Это обстоятельство, несомненно, влияет на их взаимодействие с другими белками, с ДНК и на структуру ДНК-белковых комплексов. Последнее может определять различие в выполняемых белками HmgB1 и HmgB2 функциях в клеточном ядре.

Работа выполнена при поддержке Российского Научного Фонда (грант № 22-14-00390).

Chromatin is a highly dynamic system that includes many factors. The length of DNA in a chromosome significantly exceeds the size of the nucleus of a eukaryotic cell, and the issue of DNA packaging is very important in biology, not only from a structural point of view, but also because it is closely related to the correct functioning of the entire genetic apparatus of the cell. A high degree of DNA compaction in the nucleus is achieved due to its interaction with various histone and non-histone proteins. Histones (H2A, H2B, H3 and H4) form a protein particle (nucleosome) around which DNA is wound. These particles are connected by a linker region of DNA, with which the fifth histone H1 interacts. Also proteins of a large family of non-histone proteins, proteins with high electrophoretic mobility (High Mobility Group), are associated with linker DNA. From our point of view the HmgB1 and HmgB2 proteins are the most interesting among these proteins. HmgB1 and HmgB2 are actively involved not only in the regulation of the chromatin structure, but are also directly involved in many cellular processes, such as transcription, repair, and recombination. In addition, domains homologous to the domain of the HmgB1 protein were found in many transcription factors as DNA-binding domains. Proteins HmgB1 and HmgB2 interact with DNA by a non-specific way. However, just like histone H1, they are able to recognize and bind to DNA regions with various structural disorders. It is also interesting that, under certain conditions (due to post-translational modifications or changes in redox status), HmgB1 leaves the nucleus, moves to the cytoplasm, and then enters into the extracellular space. All these processes are closely related to the development of various human diseases, ranging from cardiac pathologies to disorders in the development of the embryo, and hence with cell damage and with its death. When HmgB1 exits into cytoplasm, its amount in the nucleus decreases, while the HmgB2 protein continues to function normally. In connection with the above, it is important to understand the subtle structural differences between the HmgB1 and HmgB2 proteins, which undoubtedly affect the mechanisms of their interaction with DNA and other partners.

The HmgB1 and HmgB2 proteins are very similar in structure and amino acid sequence. Both consist of a short N-terminal region, two DNA-binding domains A and B connected by a linker, and a random C-terminal sequence of glutamine and aspartic amino acid residues. The most common method of the research of the protein secondary structure is the method of circular dichroism in the UV range. This method makes it possible to track changes in the structure of both the proteins themselves and their complexes with DNA, including the assessment of the degree of α-helicity of proteins.

In this work the secondary structure of proteins HmgB1 and HmgB2 of the calf thymus and the peculiarities of their interaction with DNA, we studied by the methods of circular dichroism (CD) and UV spectroscopy. In addition, a comparative analysis of post-translational modifications (PTMs) of HmgB1 and HmgB2 proteins was carried out using mass spectrometry.

We have shown that, despite the high conservation of their amino acid sequences of the HmgB1 and HmgB2, these proteins differ significantly from each other, which undoubtedly affects on the mechanism of interaction of these proteins with their main target in the cell nucleus, DNA. In this work it was shown that the nature of the location of PTMs in the studied proteins is different. While HmgB1 PTMs are predominantly located in the A DNA-binding domain and in the linker region between the A and B domains, PTMs of HmgB2 are concentrated in its B domain and also in the linker region. It was shown that, despite the high degree of homology between HmgB1 and HmgB2, the secondary structure of these proteins is different. An analysis of the CD spectra of proteins showed that, under physiological conditions, the HmgB1 protein is characterized by a more ordered secondary structure than HmgB2. At the same time, HmgB2 exhibits great conformational flexibility under changing external conditions. We believe that this flexibility contributes to the structural adaptation of the HmgB2 protein to a much greater extent than for the HmgB1 protein. This circumstance undoubtedly influences their interaction with other proteins, DNA and the structure of DNA-protein complexes. The latter can determine the difference in the functions performed by the HmgB1 and HmgB2 proteins in the cell nucleus.

The authors are grateful for the Russian Science Foundation (RSF) for the financial support of their research (grant No 22-14-00390).