Цитотоксины (ЦТ) из яда кобр – мембрано-активные полипептиды длиной 59-61 аминокислотных остатков. Они обладают антимикробной и антираковой активностями. В их основе — способность ЦТ дестабилизировать плазматическую мембрану бактериальных и опухолевых клеток и/или их внутриклеточных органелл. ЦТ принадлежат к семейству трёх-петлевых белков. Их структурная особенность – присутствие гидрофобного ядра, сформированного 4-мя консервативными дисульфидными связями, из которого исходят три бета-структурные шпильки, или петли. Доказано, что ЦТ взаимодействуют с липидными мембранами окончаниями этих петель [1]. С фундаментальной точки зрения представляет интерес взаимосвязь аминокислотного состава окончаний петель ЦТ с их способностью к встраиванию в мембраны различного липидного состава. Наиболее детальную информацию можно получить, проводя расчеты молекулярной динамики (МД) белка в водно-липидном окружении в полноатомном приближении. Однако на сегодняшний день имеется пример только одного такого успешного изучения: встраивания цитотоксина 2 (ЦТ2) из яда среднеазиатской кобры N. oxiana в бислой пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (ПОФХ) [1]. Показано, что в ходе МД длительностью 1 мкс молекула ЦТ2 последовательно встраивает в бислой окончания первой, второй и затем третьей петли. При рассмотрении ЦТ с менее гидрофобными окончаниями петель, например, цитотоксина 1 (ЦТ1) из яда N. oxiana, этот процесс гораздо более продолжительный. Применение «высокоподвижной модели мембраны» (HMMM, Highly Mimetic Membrane Model) [2] позволяет не только сохранить молекулярные детали взаимодействия белок-мембрана, но и ускорить процесс встраивания токсина в липидный бислой.

В модели HMMM полноразмерные молекулы липидов заменены укороченными аналогами, а в центре мембраны - слой органического растворителя, в частности, дихлорэтана. В такой мембране молекулы липидов характеризуются коэффициентами латеральной диффузии, которые на два порядка больше, чем для обычных мембран. В то же время профиль атомной плотности HMMM системы практически идентичен профилю полноразмерной модели. Это делает модель HMMM особенно привлекательной для изучения встраивания в мембрану именно периферических мембранных белков и пептидов, к которым относятся ЦТ.

В данной работе изучили встраивание и динамику ЦТ1 в бислое ПОФХ. На первом этапе применяли НМММ-приближение. В качестве стартовой модели ЦТ1 использовали структуру ЦТ1 в мицелле додецилфосфохолина [3]. Молекулу токсина располагали вне бислоя, состоящего из 200 молекул липидов (100 в каждом монослое). Варьируемым параметром модели НМММ является коэффициент масштабирования липидов (Rsa), или отношение площади, приходящейся на молекулу липида в бислое НМММ, к соответствующей площади в полноатомном бислое. Рассматривали два бислоя со значениями Rsa=1,0 и 1,1. В обоих случаях число атомов углерода в ацильной группе молекул липидов было равно 6. При Rsa=1,1 молекула ЦТ1 завершала цикл встраивания трёх петель молекулы в бислой НМММ в течение 200 нс (силовое поле CHARMM36m). При Rsa=1,0 – за ~500 нс. Для детального изучения влияния встроенной молекулы ЦТ1 на липидный бислой ПОФХ (и наоборот) на следующем этапе НМММ-мембрану конвертировали в полноатомный бислой. После уравновешивания системы МД-расчёты велись в течение 200 нс. На равновесном участке полноатомной траектории определяли значения площади, приходящиеся на молекулу липида в верхнем и нижнем монослоях, а также площадь, занимаемую молекулой токсина, и дейтериевые параметры порядка ацильных цепей молекул ПОФХ. Как для Rsa=1,0, так и 1,1 соответствующие наборы параметров оказались практически совпадающими. Это означает, что значение Rsa=1,1 является оптимальным для изучения встраивания токсина в липидный бислой, так как обеспечивает неплохое согласие с результатами полноатомной МД и при этом позволяет существенно уменьшить время вычислительного эксперимента.

Предложенный двухступенчатый подход к изучению встраивания ЦТ в липидные мембраны может быть масштабирован на другие ЦТ и периферические мембранные белки.

Работа поддержана Российским научным фондом (грант 23-44-10021).

Литература:

1. Konshina AG, Dubovskii PV, Efremov RG. Stepwise Insertion of Cobra Cardiotoxin CT2 into a Lipid Bilayer Occurs as an Interplay of Protein and Membrane "Dynamic Molecular Portraits". J Chem Inf Model. 2021, 61(1):385-399.

2. Ohkubo YZ, Pogorelov TV, Arcario MJ, Christensen GA, Tajkhorshid E. Accelerating membrane insertion of peripheral proteins with a novel membrane mimetic model. Biophys J. 2012, 102(9):2130-9.

3. Dubovskii PV, Dubinnyi MA, Volynsky PE, Pustovalova YE, Konshina AG, Utkin YN, Arseniev AS, Efremov RG. Impact of membrane partitioning on the spatial structure of an S-type cobra cytotoxin. J Biomol Struct Dyn. 2018, 36(13):3463-3478.

Cytotoxins (CT) from cobra venom are membrane-active 59-61 amino acid residue-long polypeptides. They feature antimicrobial and anticancer activities. This is due to capability of CT to destabilize the plasma membrane of bacterial and tumor cells and/or their intracellular organelles. CT belong to the family of three-finger proteins. Their structural feature is the presence of a hydrophobic core formed by 4 conservative disulfide bonds, from which three beta-structural hairpins, or fingers, protrude. CT have been proven to interact with lipid membranes via the termini of these fingers [1]. From a fundamental viewpoint, the relationship between the amino acid composition of the finger termini and capability of CT to incorporate into membranes of various lipid compositions is of interest. The most detailed information on a protein in a water-lipid environment can be obtained through molecular dynamics (MD) simulations in the full-atomic approximation. However, to date, there is only single example of such a successful study: the incorporation of cytotoxin 2 (CT2) from venom of the Central Asian N. oxiana cobra into the bilayer of palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC) [1]. It has been demonstrated that during 1 mks-long MD, the CT2 molecule embeds sequentially the termini of the first, second, and then third fingers into the bilayer. When considering a CT with less hydrophobic finger termini, for example, cytotoxin 1 (CT1) from N. oxiana venom, this process becomes much more longer. The implementation of a “Highly Mimetic Membrane Model” (HMMM) [2] allows to not only preserve the molecular details of the protein-membrane interactions, but also to accelerate the process of the toxin incorporation into the lipid bilayer.

In HMMM model, the full-sized lipid molecules are replaced with shortened analogs, and a layer of an organic solvent, in particular, dichloroethane, is added in the center of the membrane. In such a membrane, lipid molecules are characterized by lateral diffusion coefficients that are two orders of magnitude higher than for conventional membranes. At the same time, the atomic density profile of the HMMM system is almost identical to the profile of the full-size model. Thus, HMMM model becomes especially attractive for studying the incorporation into the membrane of peripheral membrane proteins and peptides, to which CT belong.

In the present work, we studied the incorporation and dynamics of CT1 in POPC bilayer. At the first stage, HMMM approximation was used. The structure of CT1 in a dodecylphosphocholine micelle was used as a starting model for CT1 [3]. The toxin molecule was placed outside the bilayer consisting of 200 lipid molecules (100 per each monolayer). The variable parameter of HMMM model is the so-called lipid scaling factor (Rsa), or the ratio of the area per lipid molecule in an HMMM bilayer to the corresponding area in the full atom bilayer. A pair of bilayers was considered with Rsa=1.0 and 1.1. In both cases, the number of carbon atoms in the acyl group of the lipid molecules was 6. At Rsa=1.1, CT1 molecule completed its cycle of the incorporation of the three-finger loops into the HMMM bilayer within 200 ns (CHARMM36m force field was used). At Rsa=1.0 – for ~500 ns. To study in detail the effect of the inserted CT1 molecule on the POPC lipid bilayer (and vice versa), at the next stage, the HMMM membrane was converted into the full-atom bilayer. After the system has been equilibrated, MD simulations were performed during 200 ns. In the equilibrium part of the full-atom trajectory, the values of the area per lipid molecule in the upper and lower monolayers, as well as the area occupied by the toxin molecule, and the deuterium order parameters of the acyl chains of POPC molecules were determined. Both for Rsa=1.0 and 1.1, the corresponding sets of the parameters turned out to be practically coincident. This means that the value of Rsa=1.1 is optimal for studying the incorporation of the toxin molecule into the lipid bilayer since it provides good agreement with the results of all-atom MD and, at the same time, can significantly reduce the overall time of the simulations. The proposed two-step approach for the study of CT incorporation into lipid membranes can be expanded to other CT and peripheral membrane proteins.

The work was supported by the Russian Science Foundation (grant no. 23-44-10021).

References:

1. Konshina AG, Dubovskii PV, Efremov RG. Stepwise Insertion of Cobra Cardiotoxin CT2 into a Lipid Bilayer Occurs as an Interplay of Protein and Membrane "Dynamic Molecular Portraits". J Chem Inf Model. 2021, 61(1):385-399.

2. Ohkubo YZ, Pogorelov TV, Arcario MJ, Christensen GA, Tajkhorshid E. Accelerating membrane insertion of peripheral proteins with a novel membrane mimetic model. Biophys J. 2012, 102(9):2130-9.

3. Dubovskii PV, Dubinnyi MA, Volynsky PE, Pustovalova YE, Konshina AG, Utkin YN, Arseniev AS, Efremov RG. Impact of membrane partitioning on the spatial structure of an S-type cobra cytotoxin. J Biomol Struct Dyn. 2018, 36(13):3463-3478.