VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г. |
Программа СъездаСекции и тезисы:
Молекулярная биофизика. Структура и динамика биополимеров и биомакромолекулярных системМодификация аптамера AS1411 с целью модуляции его аффинности к белку нуклеолину в зависимости от pH средыП.В. Габрусёнок1*, П.А. Соколов1 1.Санкт-Петербургский государственный университет; * p.v.gabrusenok(at)gmail.com Адресная доставка лекарственных препаратов к тканям и в определенные клетки до сих пор остается не решенной полностью проблемой. ДНК-аптамеры представляются перспективным средством направленной доставки противораковых препаратов в ткани организма с заданными свойствами [1]. Использование аптамеров в этом случае может снижать иммунные реакции и разнообразные побочные эффекты в том числе за счет настройки активности аптамера под такие особенности среды раковых тканей как, например, пониженное значение pH. Ранее уже была показана возможность изменения аффинности АТФ-аптамера к мишени в зависимости от pH среды путем добавления к последовательности аптамера некоторой регуляторной последовательнсти, интерферирующей со структурой аптамера в определенных диапазонах pH [2]. В данной работе экспериментально показана возможность адаптации указанного механизма pH-зависимости к аптамеру с иной структурой.
В нашей работе продемонстрирована работоспособность метода модификации консервативного аптамера AS1411 к белку нуклеолину [3], модулирующего его аффинность к мишени в зависимости от pH среды. Нуклеолин был выбран в качестве мишени для противораковой терапии [4,5] по той причине, что в здоровых клетках он находится преимущественно в клеточном ядре, а в переживших раковую трансформацию клетках наблюдается также и на клеточной стенке, и в цитоплазме [6], что делает его надежным маркером опухолевой ткани. Поскольку метод титрования мишенью модифицированного аптамера к АТФ неприменим к нуклеолиновому аптамеру в силу малой стабильности самого нуклеолина и сложности его наработки и выделения, был разработан альтернативный подход к проверке работоспособности pH-зависимой системы. Предлагаемый подход позволяет исключить использование целевых молекул (белков) из экспериментов in vitro при работе с консервативными аптамерами (такими как AS1411), переход которых в функциональную конформацию вызван не присутствием мишени, а параметрами среды. Для реализации pH-зависимой модификации, аптамерная последовательность AS1411 была дополнена 3'-концевым участком (interfere-tail), комплементарным 5'-концу аптамера (quad-tail) и содежращим один мисматч A·G. Эти последовательности были соединены политиминовым (полиТ) линкером. Снижение показателя pH приводит протонированию аденина в паре A·G, что повышает стабильность дуплекса quad-tail:interfere-tail [7]. Исходный же аптамер AS1411 при используемых в работе ионных силах и pH формирует квадруплексную структуру с температурой плавления порядка 55°С. Поэтому мы полагаем, что в случае отсутствия гибридизации участков interfere-tail и quad-tail аптамерная последовтельность AS1411 переходит к функциональной конформации, аналогично тому как это происходит с исходным аптамером AS1411 при температурах, близких к комнатной. По это причине модификация аптамера указанным спрособом позволяет изменять фракцию функцианальных аптамеров в растворах в зависимости от pH. Стабильность дуплекса quad-tail:interfere-tail оценивалась по флуоресценции красителя Cy3, находящегося на 5'-конце модифицированного аптамера, которая зависела от расстояния до тушителя BHQ2 на 3'-конце, позволяя косвенно судить о величине фракции «включенных» аптамеров. Оригинальным методом конкурентного связывания сигнальных олигонуклеотидов с интерферирующим участком interfere-tail проверяли работоспособность предложенного дизайна аптамера. Он заключался в титровании раствора модифицированного аптамера раствором сигнальных олигонуклеотидов в заданном pH. При этом в растворах с низким pH люминесценция цианиновой метки изменялась незначительно, а в растворах с pH > 6,5 при титровании наблюдался многократный рост интенсивности люминесценции, свидетельствуя о переходе аптамера к функциональной конформации. Работа поддержана грантом РНФ №22-25-00302. 1. Ireson C.R., Kelland L.R. Discovery and development of anticancer aptamers // Molecular Cancer Therapeutics. 2006. Vol. 5, № 12. P. 2957–2962. 2. Thompson I.A.P. et al. Rational design of aptamer switches with programmable pH response // Nature Communications 2020 11:1. Nature Publishing Group, 2020. Vol. 11, № 1. P. 1–7. 3. Bie L. et al. Insights into the binding mode of AS1411 aptamer to nucleolin // Front Mol Biosci. Frontiers Media S.A., 2022. Vol. 9. 4. Mosafer J. et al. Study and evaluation of nucleolin-targeted delivery of magnetic PLGA-PEG nanospheres loaded with doxorubicin to C6 glioma cells compared with low nucleolin-expressing L929 cells. // Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. Elsevier Ltd, 2016. Vol. 72. P. 123–133. 5. Brignole C. et al. Cell surface Nucleolin represents a novel cellular target for neuroblastoma therapy // Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. BioMed Central Ltd, 2021. Vol. 40, № 1. P. 1–13. 6. Mongelard F., Bouvet P. Nucleolin: a multiFACeTed protein // Trends Cell Biol. Trends Cell Biol, 2007. Vol. 17, № 2. P. 80–86. 7. Lee J.A., Derosa M.C. A pH-driven DNA switch based on the A+·G mispair // Chemical Communications. The Royal Society of Chemistry, 2010. Vol. 46, № 3. P. 418–420. Modification of the AS1411 aptamer to modulate its affinity for the nucleolin protein depending on the pH of the mediumP.V. Gabrusenok1*, P.A. Sokolov1 1.St. Petersburg State University; * p.v.gabrusenok(at)gmail.com Targeted delivery of drugs to tissues and certain cells is still an unresolved problem. DNA aptamers seem to be a promising means of targeted delivery of anticancer drugs to body tissues with desired properties [1]. The use of aptamers in this case can reduce immune response and various side effects. This is made possible by adjusting of aptamer activity to specific tissue (for example, cancer tissues have low pH value). The possibility of changing the affinity of the ATP aptamer for the target depending on the pH value has already been shown earlier [2]. This feature was achieved by adding to the aptamer sequence a certain regulatory sequence that interferes with the aptamer structure in certain pH ranges. In this work, we have experimentally shown the possibility of adapting this mechanism of pH dependence to an aptamer with a different structure.
In our work, we have demonstrated the efficiency of the method of modifying the conserved AS1411 aptamer to the nucleolin protein [3], which modulates its affinity for the target depending on the pH value of the medium. Nucleolin was chosen as a target for anticancer therapy [4, 5] because in healthy cells it is located mainly in the cell nucleus, and in cells that have undergone cancerous transformation it is also observed on the cell wall and in the cytoplasm [6], which makes it a reliable marker of tumor tissue. Since the method of titration with a target of a modified ATP-aptamer is not applicable to the nucleolin aptamer due to the low stability of the nucleolin itself and the complexity of its production and isolation, an alternative approach was developed to test the performance of the pH-dependent system. The proposed approach makes it possible to exclude the use of target molecules (proteins) from in vitro experiments when working with conservative aptamers (such as AS1411), the transition of which into a functional conformation is caused not by the presence of a target, but by environmental parameters. In order to implement the pH-dependent modification, the AS1411 aptamer sequence was supplemented with a 3'-terminal region (interfere-tail) complementary to the 5'-end of the aptamer (quad-tail) and containing one A·G mismatch. These sequences were joined by a polythymine (polyT) linker. A decrease in pH leads to the protonation of adenine in the A·G pair, which increases the stability of the quad-tail:interfere-tail duplex [7]. The initial AS1411 aptamer forms a quadruplex structure with a melting point of about 55°C at the ionic strengths and pH used in the work. Therefore, we believe that in the absence of hybridization of the interfere-tail and quad-tail regions, the AS1411 aptamer sequence goes to a functional conformation, similarly to how it occurs with the initial AS1411 aptamer at temperatures close to room temperature. For this reason, specified modification allows to change the fraction of functional aptamers in solutions depending on pH. The stability of the quad-tail:interfere-tail duplex was assessed by the fluorescence of the Cy3 dye located at the 5'-end of the modified aptamer, which depended on the distance to the BHQ2 quencher at the 3'-end, making it possible to indirectly judge the size of the "enabled" aptamer fraction. An original method of competitive binding of signal oligonucleotides to an interfering interfere-tail region was used to test the performance of the proposed aptamer design. It consisted in titration of the modified aptamer solution with a solution of signal oligonucleotides at a given pH. The luminescence of the cyanine label stayed at low level when titrated with signal oligos in solutions with low pH. However, in solutions with pH > 6.5, a significant increase in the luminescence intensity was observed during titration, indicating the transition of the aptamer to a functional state. This research was supported by the Russian Science Foundation grant 22-25-00302. 1. Ireson C.R., Kelland L.R. Discovery and development of anticancer aptamers // Molecular Cancer Therapeutics. 2006. Vol. 5, № 12. P. 2957–2962. 2. Thompson I.A.P. et al. Rational design of aptamer switches with programmable pH response // Nature Communications 2020 11:1. Nature Publishing Group, 2020. Vol. 11, № 1. P. 1–7. 3. Bie L. et al. Insights into the binding mode of AS1411 aptamer to nucleolin // Front Mol Biosci. Frontiers Media S.A., 2022. Vol. 9. 4. Mosafer J. et al. Study and evaluation of nucleolin-targeted delivery of magnetic PLGA-PEG nanospheres loaded with doxorubicin to C6 glioma cells compared with low nucleolin-expressing L929 cells. // Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. Elsevier Ltd, 2016. Vol. 72. P. 123–133. 5. Brignole C. et al. Cell surface Nucleolin represents a novel cellular target for neuroblastoma therapy // Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. BioMed Central Ltd, 2021. Vol. 40, № 1. P. 1–13. 6. Mongelard F., Bouvet P. Nucleolin: a multiFACeTed protein // Trends Cell Biol. Trends Cell Biol, 2007. Vol. 17, № 2. P. 80–86. 7. Lee J.A., Derosa M.C. A pH-driven DNA switch based on the A+·G mispair // Chemical Communications. The Royal Society of Chemistry, 2010. Vol. 46, № 3. P. 418–420. Докладчик: Габрусёнок П.В. 195 2023-02-14
|