Для сложных полимерных субстратов давно известна важность характера адсорбции фермента, которая может быть или продуктивной, предшествующей каталитической стадии процесса, или непродуктивной, блокирующей действие фермента. В последние два десятилетия обнаружились новые аспекты, связанные с особой формой устойчивости бактерий к действию антибактериальных факторов иммунной системы. Выявляются всё новые молекулярные структуры поверхности бактериальных клеток, способные целенаправленно связывать антибактериальный фермент лизоцим, тем самым блокируя механизмы дезинтеграции бактерий при их поглощении иммунной клеткой фагоцитом, что соответственно блокирует как процесс обезвреживания бактерии, так и последующую презентацию бактериальных антигенов, необходимую образования специфических антител.

В данной работе проводилось исследование параметров адсорбции фермента лизоцима непосредственно на живых целых бактериальных клетках в условиях протекания ферментативного лизиса (разрушения) бактерий. В качестве модельного фермента использовался лизоцим куриного яйца, который в настоящее время применяется в составе медицинских препаратов и который имеет сходную структуру с лизоцимом человека. В качестве бактерий исследовали грамотрицательные бактерии Escherichia coli семейства Enterobacteriaceae, грамположительные спорообразующие бактерии Bacillus subtilis семейства Bacillaceae и грамположительные Lactobacillus plantarum семейства Lactobacillaceae.

Было показано, что адсорбция лизоцима имеет обратимый характер, а равновесие устанавливается менее чем за 3-5 мин при температуре 37 °C. После установления равновесия изотермы адсорбции во всех случаях удовлетворительно аппроксимируются уравнением Ленгмюра. Анализ экспериментальных данных не выявил одновременного наличия разных центров связывания лизоцима на бактериальных клетках, для которых существенно отличаются равновесные параметры адсорбции. При разной доле лизированных клеток после инкубации смеси бактерий с лизоцимом в течение 5 минут и 20 минут сорбционные характеристики не меняются в пределах погрешности, таким образом, характер адсорбции лизоцима на целых клетках и на обломках клеток одинаковый. Адсорбционная ёмкость это максимальное количество связываемого клетками лизоцима в данных условиях, Amax. Amax уменьшается при повышении и понижении значения pH от оптимума активности. Amax составляет от 2.7·10^7 до 1.5·10^8 молекул лизоцима на одну клетку в зависимости от вида бактерий. В случае клеток бактерий E. coli и B. subtilis обнаружено двукратное снижение скорости ферментативного лизиса клеток (VL) при уменьшении ионной силы раствора в диапазоне 80 мМ – 5 мМ. Изучение кинетических параметров показало, что снижение скорости лизиса клеток происходит за счёт увеличения константы Михаэлиса (Км) при неизменности максимальной скорости лизиса клеток (Vmax). Было выяснено, что при снижении ионной силы уменьшается константа десорбции лизоцима (Кd) при неизменности Amax. Кd уменьшается до 10 раз для E.coli до 1.2·10^-7 М. Кd уменьшается до 3 раз для В. subtilis до 2.4·10^-7 М. Можно предположить увеличение вклада непродуктивной сорбции лизоцима на бактериях E. coli и B. subtilis при понижении ионной силы. В случае клеток L. plantarum при изменении ионной силы раствора в диапазоне 80 мМ – 5 мМ не происходит драматических изменений параметров адсорбции лизоцима и VL. В случае E. coli наблюдается увеличение VL в 1.5-2.0 раза в присутствии свободных аминокислот глицина, гистидина и заряженных аминокислот (Gly, His, Asp, Glu, Arg, Lys) в концентрации 1-5 мМ. В присутствии этих аминокислот Amax не меняется, а Кd уменьшается. Таким образом, активирующие ферментативный лизис добавки, вероятно, увеличивают вклад продуктивной сорбции.

Бактериальные инфекции семейств Enterobacteriaceae и Bacillaceae (например, брюшной тиф, сальмонеллёз, бактериальная дизентерия, сибирская язва) особенно опасны тем, что эти бактерии потенциально могут связывать лизоцим фагоцитирующих иммунных клеток и использовать фагоциты в качестве контейнеров для распространения бактерий по организму. Поэтому новая информация об эффекторах, препятствующих непродуктивной адсорбции лизоцима, особенно важна для разработки новых антибактериальных лекарственных препаратов.

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова в рамках государственного задания «Молекулярный дизайн, структурно-функциональный анализ и регуляция ферментных систем, клеточных конструкций, бионаноматериалов: фундаментальные основы и приложения в технологии, медицине, охране окружающей среды» Номер ЦИТИС: 121041500039-8.

For complex polymeric substrates, the importance of the type of enzyme adsorption has long been known. It can be either productive, i.e., preceding the catalytic stage of the process, or unproductive, in which it blocks the action of the enzyme. During the past two decades, new aspects have been discovered in association with a special form of bacterial resistance with respect to the action of antibacterial factors of the immune system. Increasingly, new molecular structures of the surface of bacterial cells are being revealed to be capable of purposely binding the antibacterial enzyme lysozyme, thereby blocking the mechanisms of bacterial disintegration during phagocytosis by an immune cell, which in turn blocks the process of neutralizing the bacterium and the subsequent presentation of bacterial antigens, the latter of which is necessary for the formation of specific antibodies.

In this study we examined the parameters of adsorption of the enzyme lysozyme directly on living whole bacterial cells under conditions of enzymatic lysis (destruction) of bacteria. Chicken-egg lysozyme, which is currently used in medical preparations and has a structure similar to that of human lysozyme, was used as a model enzyme. Gram-negative bacteria Escherichia coli of the Enterobacteriaceae family, Gram-positive spore-forming bacteria Bacillus subtilis of the Bacillaceae family, and Gram-positive Lactobacillus plantarum of the Lactobacillaceae family were studied as bacteria.

It was shown that the adsorption of lysozyme is reversible and that equilibrium is established in less than three to five minutes at a temperature of 37°C. Once equilibrium is established, the adsorption isotherms in all cases are satisfactorily approximated by the Langmuir equation. An analysis of the experimental data did not reveal the simultaneous presence of different lysozyme binding sites on bacterial cells, thus indicating that the equilibrium adsorption parameters differ significantly. With a different proportion of lysed cells, following incubations of a mixture of bacteria with lysozyme for 5 minutes and 20 minutes, respectively, the adsorption characteristics did not change in excess of the error margin, indicating that the nature of lysozyme adsorption on whole cells and on cell fragments is the same. The adsorption capacity is the maximum amount of lysozyme that can bind to bacterial cells under specified conditions (Amax). Amax, however, decreases as the pH value rises and falls from the activity optimum. Amax ranges from 2.7·10^7 to 1.5·10^8 lysozyme molecules per cell, depending on the type of bacteria. In the case of bacterial cells E. coli and B. subtilis, a twofold decrease in the rate of enzymatic cell lysis (VL) was found along with a decrease in the ionic strength of the solution in the range of 80 mM to 5 mM. The study of kinetic parameters showed that a decrease in the rate of cell lysis occurs due to an increase in the Michaelis constant (Km) but that the maximum rate of cell lysis (Vmax) remains unchanged. It was found that, with a decrease in ionic strength, the desorption constant of lysozyme (Kd) decreases while Amax remains unchanged. Kd decreases up to 10 times for E. coli (upto 1.2·10^-7 M), and Kd decreases up to three times for B. subtilis (upto 2.4·10^-7 M). An increase in the contribution of unproductive adsorption of lysozyme on bacteria E. coli and B. subtilis can be assumed but with decreasing ionic strength. In the case of L. plantarum cells, when the ionic strength of the solution changes in the range of 80 mM to 5 mM, there is no significant change in the adsorption parameters of lysozyme and VL. In the case of E. coli, an increase in VL by a factor of 1.5 to 2.0 is observed in the presence of free amino acids glycine, histidine and charged amino acids (Gly, His, Asp, Glu, Arg, Lys) at a concentration of 1–5 mM. In the presence of these amino acids, Amax does not change, but Kd decreases. Consequently, the additives that activate enzymatic lysis probably increase the contribution of productive sorption.

Bacterial infections of the Enterobacteriaceae and Bacillaceae families (e.g., typhoid fever, salmonellosis, bacillary dysentery, anthrax) are especially dangerous because these bacteria can bind the phagocyte lysozyme and use phagocytes as containers for spreading the bacteria throughout the body. Therefore, new information on effectors that prevent unproductive adsorption of lysozyme is particularly important in the development of new antibacterial drugs.

The work was performed at the Department of Chemical Enzymology of the Faculty of Chemistry of Lomonosov Moscow State University within the framework of the state task “Molecular design, structural and functional analysis and regulation of enzyme systems, cellular structures, bionanomaterials: fundamental foundations and applications in technology, medicine, environmental protection” Number CITIS: 121041500039-8.