Современная терапия и диагностика при различных патогенных состояниях, включая рак, основана на применении специфических полноразмерных антител и их фрагментов: на сегодняшний день около трети от общего количества белков, применяемых в терапии различных заболеваний, составляют антитела. Лабораторные методы in vitro, используемые при разработке антител наибольшей аффинности и специфичности, такие как поверхностный плазмонный резонанс, иммуноферментный анализ, биослойная интерферометрия и другие, предполагают использование стандартных физиологических буферов. Однако реальные in vivo условия, в которых антитела должны проявлять свою аффинность и стабильность, отличаются присутствием молекул различной природы, характерных для физиологических жидкостей человека. В плазме крови и межклеточной жидкости, являющихся обычными средами для функционирования антител, необходимо учитывать такие мажорные компоненты, как сывороточный альбумин (ЧСА), содержание которого в плазме крови достигает 60% от общей массы белков, а также низкомолекулярные компоненты и ионы. Понимание механизма действия таких добавок позволит повышать эффективность антител.

Семейство факторов роста эндотелия сосудов (VEGF) является важнейшим регулятором целого ряда физиологических и патологических процессов. К физиологическим эффектам данного семейства можно отнести участие в васкулогенезе, заживлении ран, формировании костей, процессах роста и развития. Рецепторы к данному фактору присутствуют как на эндотелиальных, так и на других типах клеток, чем обусловлены множественные эффекты VEGF. Среди патологических процессов, в которых участвует VEGF, можно выделить онкологические заболевания (такие как рак молочной железы, лейкозы, глиобластома, колоректальный рак), макулодистрофия, преэклампсия, диабетическая ретинопатия. В связи с этим VEGF стал одной из мишеней воздействия при лечении указанных заболеваний. Широкое применение получили препараты на основе антител к VEGF. Коммерческий препарат авастин (действующее вещество бевацизумаб) представляет собой рекомбинантное гиперхимерное гуманизированное моноклональное антитело, содержащее полностью человеческие каркасные участки с определяющими комплементарность участками гиперхимерного антитела мыши, которые связываются с VEGF.

В данной работе было проведено исследование влияния ЧСА на процесс связывания VEGF-A165 ¬¬– наиболее распространенного и важного из факторов роста – и моноклонального антитела бевацизумаба методом интерферометрии поверхностного био-слоя (ИПС) с использованием OCTET QKE SYSTEM. VEGF-A165 (0,5 мкМ) иммобилизовали химически через аминогруппы на поверхности биосенсора. Концентрация бевацизумаба в экспериментах составила 15 и 20 нМ. В качестве целевой добавки использовался сывороточный альбумин в концентрациях 60 мкМ и 600 мкМ. Расчет констант взаимодействия лиганда (VEGF-А165) с аналитом (бевацизумабом) проводили с использованием схемы бивалентного аналита с использованием стандартной программы Octet Data Analysis. Равновесная константа диссоциации VEGF-А165 и бевацизумаба (0,15±0,43) нМ, совпадает с литературными данными, при этом добавление сывороточного альбумина в концентрации 600 мкМ увеличило её в 350 раз: (53±45) нМ. В присутствии ЧСА на порядок уменьшилась константа скорости ассоциации, а константа скорости диссоциации увеличилась в 20 раз.

Для проведения in silico анализа взаимодействий антиген-бевацизумаба, а также установления возможного механизма влияния сывороточного альбумина на комплекс антиген-антитело, были смоделированы модели полноразмерного антитела и VEGF-A165. Моделирование проводилось на основе доступной кристаллической структуры фрагмента бевацизумаба (мутантная форма), доступной в PDB банке (PDB код 6BFT) и предсказанными серверами AlphaFold (https://alphafold.ebi.ac.uk/) и I-Tasser (https://zhanggroup.org/I-TASSER/) тяжелой и легкой цепей бевацизумаба. В качестве основы для моделирования VEGF были взяты трехмерные структуры доменов RBD (рецептор-связывающий домен) и HBD (гепарин-связывающий домен): 2VPF и 1VGH, соответственно. Гомодимерная форма белка VEGF-A165 была предсказана сервером AlphaFold в режиме мультимера. Выравнивание, уточнение и визуализация трехмерных структур осуществлялись с помощью PyMOL v.2.5, онлайн сервиса Pairwise Structure Alignment RCSB PDB и сервера Stride. Расчет содержания элементов вторичной структуры в модели VEGF-A165, а также линейные размеры молекулы соответствовали экспериментальным данным, полученным методами кругового дихроизма и динамического рассеяния света. Для моделирования комплексов VEGF-A165–бевацизумаб, ЧСА-бевацизумаб, VEGF-A165-ЧСА, а также их тройного комплекса использовался сервер ClusPro. Выявлено частичное перекрывание областей связывания VEGF-A165-ЧСА и VEGF-A165–бевацизумаб, что может объяснять изменение равновесной константы диссоциации.

Таким образом, впервые были получены данные о степени влияния

ЧСА на взаимодействие бевацизумаба с VEGF-A165, что может учитываться при терапии с использованием данного антитела, а также разработке других терапевтических антител c максимальной специфичностью к мишеням в различных условиях и функциональной стабильностью.



Исследования выполнены при поддержке гранта РНФ № 22-24-00083 (Е.И. Дерюшева)

Current therapy and diagnostic used in different diseases including cancer is based on specific full-length antibodies or their fragments treatment. Nowadays about a third of therapeutic proteins are antibodies. Laboratory methods in vitro used for high-affinity and high-specificity antibodies development such as surface plasmon resonance, immunoassay analysis, bio-layer interferometry and others are usually carried out with standard buffers. However, antibody exhibits its stability and affinity under in vivo conditions of physiological human fluids containing many other molecules. In human plasma and intercellular fluid that are normal functioning environment of antibodies such major components as serum albumin (HSA) and low-molecular-weight components and ions are needed to be considered. Knowing of the mechanism of the components influence is of interest to improve the antibodies efficiency.

Vascular endothelial growth factors (VEGFs) family is the most important regulator of a wide range of physiological and pathological processes such as vasculogenesis, wound healing, bone formation, growth, and development. VEGF receptors are presented on the surface of endothelial and other cell types, and it causes multiple effects of VEGF. Such pathological processes as cancer (mammary cancer, leukemia, glioblastoma, colorectal cancer), macular degeneration, preeclampsia, diabetic retinopathy proceeds with VEGF as a key mediator. Thereby VEGF became one on the target during the mentioned diseases treatment, and anti-VEGF antibodies-based drugs are widely used today. Avastin (commercial name of bevasizumab) is a recombinant hyperhimeric humanized monoclonal antibody containing fully human framework regions with complementarity-determining regions of a mouse hyperchimeric antibody binding to VEGF.

In this work, human serum albumin influence on the most common and important growth factor VEGF-A165 binding to monoclonal antibody bevacizumab was studied with bio-layer interferometry using OCTET QKE SYSTEM. VEGF-A165 (0,5 μM) was chemically immobilized on biosensor layer. Bevacizumab concentrations were 15 and 20 nM. Determined equilibrium dissociation constant of VEGF-A165-bevacizumab (0,15±0,43) nM corresponds to the literature data. Addition of 600 μM HSA leads to an increase of the equilibrium constant in 350 times, wherein kinetic association constant decreased by an order of magnitude and dissociation constant increased in 20 times.

For in silico analysis of antigen-bevacizumab interactions, as well as to establish a possible mechanism for the effect of serum albumin on the antigen-antibody complex, full-length antibody and VEGF-A165 models were modeled. Modeling was performed based on the available crystal structure of the bevacizumab fragment (mutant form), available in the PDB bank (PDB code 6BFT) and predicted by the AlphaFold (https://alphafold.ebi.ac.uk/) and I-Tasser (https:// zhanggroup.org/I-TASSER/) heavy and light chains of bevacizumab. The tertiary structures of the RBD (receptor-binding domain) and HBD (heparin-binding domain) domains were taken as the basis for VEGF modeling: 2VPF and 1VGH, respectively. The homodimeric form of the VEGF-A165 protein was predicted by the AlphaFold server in multimer mode. Alignment, refinement and visualization of three-dimensional structures were carried out using PyMOL v.2.5, the Pairwise Structure Alignment RCSB PDB online service and the Stride server. The content of secondary structure elements in the VEGF-A165 model, as well as the linear sizes of the molecule, corresponds to the experimental data obtained by circular dichroism and dynamic light scattering. The ClusPro server was used to predict the VEGF-A165–bevacizumab, HSA-bevacizumab, VEGF-A165-HSA complexes, as well as their ternary complex. Partial overlapping of the binding regions of VEGF-A165-HSA and VEGF-A165–bevacizumab was revealed; this fact may explain the change in the equilibrium dissociation constant.

Thus, for the first time, experimental data were obtained on the influence degree of human serum albumin on the interaction of VEGF-A165 with bevacizumab. The data may be used during therapy with the antibody, and development of another high-specific and functionally stable antibodies in different conditions.



The research was supported by a grant from the Russian Science Foundation grant No. 22-24-00083 (E.I. Deryusheva).