VII Съезд биофизиков России
Краснодар, Россия
17-23 апреля 2023 г.
Главная
О Съезде
Организаторы
Программный комитет
Программа Съезда
Место проведения Съезда
Проживание
Оргвзносы
Основные даты
Регистрация
Публикации материалов Съезда
Молодежный конкурс
Контакты
Тезисы
English version
Партнеры Съезда
Правила оформления докладов

Программа Съезда

Секции и тезисы:

Молекулярная биофизика. Структура и динамика биополимеров и биомакромолекулярных систем

Разделение фаз N-белка SARS-CoV-2 и вирусной РНК: предполагаемый механизм и регуляция нуклеозидными производными

Ю.И. Светлова1, В.Б. Цветков1, Е.К. Книжник1, Т.С. Ведехина1, А.М. Варижук1*

1.Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина ФМБА, Москва, Россия;

* annavarizhuk(at)gmail.com

Нуклеокапсидный белок (N) коронавируса, ассоциированного с острым респираторным синдромом (SARS-CoV-2), способен формировать в водных средах биомакромолекулярные конденсаты с РНК по механизму разделения фаз “жидкость-жидкость” (LLPS). Предполагается, что подобное разделение фаз в цитоплазме клетки-хозяина значимо для уклонения вируса от иммунной системы за счет блокирования внутриклеточного сигнального пути, а также является необходимым этапом репликации вируса. В принятой для описания многокомпонентных конденсатов модели “скаффолд-клиент” роль скаффолда, т.е. индуктора разделения фаз, отводится белку N. В роли клиентов могут выступать компоненты репликационного/транскрипционного аппарата. Их концентрирование и перераспределение на геномной РНК SARS-CoV-2 инициирует репликацию-транскрипцию и переключение с классической транскрипции на прерывистую для наработки субгеномных РНК.

Ранее было показано, что низкомолекулярные модуляторы LLPS, способные снижать плотность конденсатов, усиливают активность ингибиторов вирусной полимеразы, облегчая им доступ к мишени. Наряду с ингибиторами LLPS N-РНК, они могут найти применение в разработке стратегий комбинированной противовирусной терапии, а дальнейшее исследование фазовых переходов N-РНК может способствовать рациональному дизайну противовирусных агентов нового поколения. Соединения, стабилизирующие конденсаты, в теории способны нарушать жизненный цикл вируса, блокируя распаковку нуклеокапсида непосредственно после заражения, и также представляются терапевтически значимыми. Несмотря на растущий интерес, поиск и характеристика подобных модуляторов LLPS N-РНК находятся на начальном этапе. Одним из ограничений является отсутствие простой и адекватной in vitro-модели конденсатов.

Целью данной работы было получение модели конденсатов N-РНК при физиологических условиях и оценка влияния нуклеозидных/нуклеотидных аналогов из числа известных противовирусных агентов на эти конденсаты. Ключевое отличие предложенной модели от описанных ранее состоит в выборе фрагментов РНК и соотношения N:РНК. Были использованы участки генома SARS-CoV-2, которые содержат узнаваемые N элементы первичной и вторичной структуры, тогда как в предыдущих исследованиях использовались преимущественно олигорибонуклеотиды случайного состава. Выбранное нами соотношение N:РНК в первом приближении соответствует таковому в вирионах SARS-CoV-2. Предпосылками к рассмотрению влияния нуклеозидных/нуклеотидных аналогов на LLPS N-РНК послужили результаты недавних исследований чувствительности вирусных конденсатов к АТФ, который можно назвать основным эндогенным модулятором фазовых переходов биополимеров.

Для получения конденсатов в условиях, имитирующих физиологические, были использованы флуоресцентно-меченный рекомбинантный N-белок и РНК из 5’-нетранслируемой области вирусного генома, формирующая разветвленную шпильку с мотивами узнавания N; разделение фаз регистрировали методами флуоресцентной микроскопии и турбидиметрии. Для валидации модели конденсатов сопоставляли ожидаемые и наблюдаемые эффекты рН, температуры, ионной силы раствора, а также контрольных известных модуляторов. Для оценки влияния нуклеозидных/нуклеотидных модуляторов рассчитывали изменения коэффициента разделения N и общей площади конденсатов на единицу поверхности по данным флуоресцентной микроскопии смеси N-РНК в присутствии/в отсутствие модуляторов. Влияние нуклеозидных/нуклеотидных аналогов на конденсаты соотносили с противовирусной активностью в клеточной модели.

Ключевым результатом анализа чувствительности конденсатов к внешним факторам можно считать косвенное подтверждение гипотезы, объясняющей связь специфических электростатических взаимодействий N-РНК и неспецифических гидрофобных взаимодействий неструктурированных участков N. Согласно этой гипотезе, механизм РНК-зависимого фазового перехода включает следующие этапы: 1) узнавание мотивов, характерных для 5’-нетранслируемой области вирусного генома, РНК-связывающим доменом N повышает вероятность контактов остова соседнего участка РНК с положительно заряженным фрагментом N возле димеризационного домена; 2) связывание РНК меняет конформацию димеризационного домена, вызывая его частичную денатурацию; 3) частичная денатурация белка и экспонирование гидрофобных участков инициируют фазовый переход.

Ключевым результатом анализа эффектов нуклеозидных/нуклеотидных аналогов является установление слабой корреляции между модуляцией LLPS N-РНК и противовирусной активностью в ряду 5’-норкарбоциклических нуклеозидных производных и соединений с флексимерными аналогами нуклеиновых оснований [1]. В случае ненуклеозидных модуляторов – производных перилена подобной корреляции не наблюдалось. Лидерами из числа нуклеозидных аналогов оказались 5’-норкарбоциклические производные, увеличивающие эффективность разделения фаз N в 11-15 раз. Эти соединения представляются перспективной основой для разработки терапевтических агентов, однако для учета возможных побочных эффектов потребуется проверка их действия на конденсаты (немембранные органеллы) клетки-хозяина.

Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации № МД-5000.2022.3.

[1] J Svetlova et al. Nucleoside Analogs and Perylene Derivatives Modulate Phase Separation of SARS-CoV-2 N Protein and Genomic RNA In Vitro. International Journal of Molecular Sciences 2022, 23 (23): 15281.

Phase separation of SARS-CoV-2 N-protein and viral RNA: possible mechanism and regulation by nucleoside derivatives

J. Svetlova1, V. Tsvetkov1, E. Knizhnik1, T. Vedekhina1, A. Varizhuk1*

1.Lopukhin Federal research and clinical center of physical-chemical medicine, FMBA, Moscow, Russia;

* annavarizhuk(at)gmail.com

The nucleocapsid protein (N) of severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) tends to form biomacromolecular condensates with RNA in aqueous media via the liquid-liquid phase separation (LLPS) mechanism. N-RNA LLPS in the cytoplasm of the host cell supposedly enables viral immune evasion by blocking an intracellular signaling pathway and may contribute to viral replication. Within the framework of the “scaffold-client” model, which is typically used to describe multicomponent condensates, N protein can be regarded as the main driver (“scaffold”) of LLPS, and its “clients” include the components of the replication/transcription machinery. Their concentration and redistribution on SARS-CoV-2 genomic RNA are needed for the onset of replication-transcription and the switch from classical to discontinuous transcription, respectively, resulting in the production of genomic and subgenomic RNA.

Previously, small-molecule LLPS modulators that reduce condensate density, have been shown to enhance the activity of viral polymerase inhibitors by facilitating their access to the target. Such modulators and inhibitors of N-RNA LLPS may find application in the development of combination strategies for antiviral therapy, and further investigation of N-RNA phase transitions may contribute to the rational design of new antivirals. Condensate-stabilizing compounds, in turn, are theoretically capable of disrupting the viral life cycle by the unpacking of the nucleocapsid right after infection. Thus, they may also prove to be therapeutically relevant. Despite the growing interest to this matter, studies of N-RNA LLPS modulators are at an early stage. One limitation is the lack of a simple and adequate in vitro model of the condensates.

The aim of this work was to obtain a model of N-RNA condensates under physiological conditions and to evaluate the effects of known nucleoside/nucleotide-based antivirals on these condensates. The key difference between the proposed model and those described previously is the choice of RNA and N-RNA ratio. We used fragments of the SARS-CoV-2 genome that contain primary and secondary structure elements recognized by N protein, while in previous studies random-sequence oligoribonucleotides were typically used. We also used an N:RNA ratio comparable to that expected in SARS-CoV-2 virions. Nucleoside/nucleotide analogs were considered as possible modulators of N-RNA LLPS based on the reports of condensate sensitivity to ATP, which is arguable the key endogenous modulator of biopolymer phase transitions.

The condensates were obtained using a fluorescently labeled recombinant N protein and an RNA sequence from the 5'-untranslated region of the viral genome, which forms a branched hairpin and contains sequences recognized by N protein. Phase separation was confirmed using fluorescence microscopy and turbidimetry. The model of the condensates was validated by comparing observed and predicted effects of pH, temperature, solution ionic strength, and known modulators. To assess the effects of nucleoside/nucleotide modulators, changes in N partitioning coefficient and the total area of the condensates per surface unit were calculated based on fluorescence microscopy analyses of N-RNA mixtures in the presence/absence of the modulators. Finally, the effects of nucleoside/nucleotide analogs on the condensates were correlated with antiviral activity in cells.

Analysis of condensate sensitivity to external factors supported the recently proposed hypothesis explaining the relationship between specific electrostatic N-RNA interactions and nonspecific hydrophobic interactions within unstructured N regions. According to that hypothesis, the mechanism of the RNA-dependent phase transition includes the following steps: 1) recognition of sequence motifs characteristic of the 5'-untranslated region of the viral genome by the RNA-binding domain of N increases promotes contacts between the backbone of the adjacent RNA region and the positively charged N fragment near the dimerization domain; 2) RNA binding alters the conformation of the dimerization domain, causing its partial denaturation; 3) partial protein denaturation and exposure of hydrophobic regions initiate the phase transition.

Analysis of the effects of nucleoside/nucleotide analogs revealed weak correlation between LLPS modulation and antiviral activity in the series of 5'-norcarbocyclic nucleoside derivatives and fleximer-containing nucleoside analogs [1]. Non-nucleoside modulators, such as perylene-based antivirals, showed no such correlation. In the nucleoside analog series, top effects were obtained for 5'-norcarbocyclic derivatives, which caused up to 15-fold increase in the efficiency of N separation. These compounds might hold promise for the development of therapeutic agents. However, to take into account possible side effects, their effects on host cell condensates (membraneless organelles) should be tested.

This work was supported by a grant from the President of the Russian Federation No. MD-5000.2022.3.

[1] J Svetlova et al. Nucleoside Analogs and Perylene Derivatives Modulate Phase Separation of SARS-CoV-2 N Protein and Genomic RNA In Vitro. International Journal of Molecular Sciences 2022, 23 (23): 15281.


Докладчик: Варижук А.М.
484
2023-01-15

Национальный комитет Российских биофизиков © 2022
National committee of Russian Biophysicists